DNA甲基轉移酶與心臟纖維化的研究進展

謝青文 唐其柱

心臟纖維化是各種心血管疾病不可避免的病理改變之一，主要是由于細胞外基質過度沉積，致使心臟收縮和舒張功能障礙，最終導致心律失常和心力衰竭。心臟纖維化的主要效應細胞成纖維細胞可被各種病理刺激激活，從而進行增殖，分化為肌成纖維細胞，并產生各種細胞因子和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)蛋白。目前還沒有治療心臟纖維化的方法，因此了解心臟纖維化的病理發生機制具有重要意義。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳機制，通常發生在對環境刺激的反應中，在調控基因表達中起關鍵作用。最近研究表明，DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)在心臟纖維化中起著重要作用，控制DNA甲基化可能成為抗纖維化治療的新策略。本文就DNA甲基轉移酶在心臟纖維化中的作用最新研究進展進行綜述，尋找心臟纖維化治療新靶點。

一、DNMTs概述

DNA 甲基化是指DNA的特定堿基在DNMTs的作用下，共價結合一個甲基基團的化學修飾過程，可以發生在多個堿基基團上。在一般研究中，主要是指在胞嘧啶第5位碳原子上添加一個甲基，產生 5-甲基胞嘧啶(5-mC)的過程，通過基因啟動子區域的DNA甲基化參與轉錄基因沉默。在真核生物中，DNA甲基化主要發生在CpG島，主要DNMTs和甲基結合蛋白調控。目前，哺乳動物中共發現了五種DNMT 蛋白，但只有 DNMT1、DNMT3A 和 DNMT3B 具有甲基轉移酶活性[1]。在DNA復制過程中，DNMT1將DNA甲基化從母鏈復制到新合成的子鏈。DNMT3A和DNMT3B參與從頭甲基化，在缺乏模板的情況下建立新的DNA甲基化模式。已有研究表明，在人類和小鼠心臟中表達的主要DNA甲基轉移酶是DNMT3B，而其他甲基轉移酶，DNMT1和DNMT3A幾乎檢測不到，而且DNMT3B敲除的心臟中存在著廣泛的間質纖維化[2]。另外有研究發現，在異丙腎上腺素誘導的大鼠心臟纖維化模型中，心臟成纖維細胞DNMT3A表達上調，miR-29a及其miR-26a-5p通過下調DNMT3A而降低成纖維細胞的增殖和活化，從而改善心臟纖維化[3,4]。這些結果說明，DNMTs各亞型在心臟纖維化中的作用不同，還需更多研究去探索DNMTs參與心臟纖維化的作用機制。無論是心肌梗死引起的急性缺血性損傷，慢性高血壓引起的壓力超載，還是糖尿病引起的代謝功能障礙，均能使心臟細胞DNA甲基化機制功能失調，導致心臟纖維化。下面筆者將討論DNMTs在缺血性心肌病、壓力負荷誘導的心肌病以及糖尿病性心肌病等心臟纖維化病理機制中的作用。

二、DNMTs與心臟纖維化發生的關系

1.缺血性心肌病：DNA甲基化在缺血性心肌病中發揮重要作用。實驗證實轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可抑制DNMT1蛋白的表達和活性，從而抑制α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)啟動子甲基化，導致心肌梗死區α-SMA表達大幅增加。但是在該研究中， DNMT3A和DNMT3B表達水平差異無統計學意義[5]。Jeong等[6]研究發現在心肌梗死中，DNMTs抑制劑5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5AZA)可顯著改善心臟功能和纖維化，這與巨噬細胞中干擾素調節因子-1(interferon regulatory factor-1，IRF1)的SUMO化有關。內皮細胞通過內皮-間充質轉化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)獲得纖維增殖表型，在新生內膜病變的形成中發揮關鍵作用。缺氧可通過低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1 α，HIF1α)和TGF/SMAD信號通路通過DNMT3A介導的Ras-Gap樣蛋白1(Ras-Gap-like protein 1，RASAL1)啟動子的高甲基化，誘導人冠狀動脈內皮細胞EndMT[7]。

人冠狀動脈內皮細胞暴露于高磷酸鹽環境時也發生EndMT。進一步研究證明，這種EndMT是通過組蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2，HDAC2)將異常磷酸化的DNMT1募集到RASAL1 CpG島啟動子上，并激活常見的EndMT調控因子Twist和Snail而導致的[8]。缺氧產生的自由基也可能激活Snail，上調DNMT1和DNMT3B，使RASSF1A蛋白合成顯著減少，相關纖維化標志物增加。細胞外超氧化物歧化酶可以通過Ras/ERK途徑顯著降低DNMT1和DNMT-3B介導的RASSF1A基因甲基化，從而緩解缺氧誘導的心臟纖維化[9]。在研究血管成形術誘導再狹窄機制時，發現豬冠狀動脈DNMT1和DNMT3A對細胞因子信號的抑制基因(suppression of cytokine signaling 3，SOCS3)具有抑制作用，抑制DNMT1和DNMT3A對防止冠狀動脈再狹窄可能具有重要臨床意義[10]。同時，該研究還發現抑制血管平滑肌細胞DNMT1可誘導DNMT3A表達。DNMT1和DNMT3A之間存在一種相互調節的機制，在DNMT1缺失的情況下，誘導DNMT3A可補償DNMT1功能的喪失。這些研究結果表明，在缺血性心肌病中，DNMTs通過沉默基因表達發揮促纖維化或抗纖維化作用，但是DNMTs抑制劑治療心臟纖維化卻表現出積極作用。

2.壓力負荷誘導的心肌病：在壓力負荷誘導的心肌病中，心臟纖維化是心肌重構的一個重要病理改變。微小RNA與DNA甲基化的相互作用可能是心臟纖維化疾病遺傳因素缺失的原因。腹主動脈縮窄術后的大鼠纖維化心臟及雷帕霉素誘導的心臟成纖維細胞自噬中，DNMT3A表達水平均上調。DNMT3A通過調控miR-200b參與心臟成纖維細胞自噬[11]。同樣地，Tao等[12]研究發現，腹主動脈縮窄大鼠心臟DNMT3A及纖維化相關蛋白α-SMA和膠原蛋白Ⅰ表達顯著升高。心臟成纖維細胞轉染DNMT3A-siRNA對TGF-β1誘導的成纖維細胞增殖有明顯抑制作用。miR-369-5p介導的Patched1的DNMT3A表觀遺傳沉默是心肌纖維化中成纖維細胞增殖的機制。容量負荷誘導的心衰小鼠心臟中的DNMT1水平上調，TIMP4表達下調，相應的，MMP9的表達也上調，使ECM蛋白產生與降解失衡[13]。低劑量5-AZA可以減輕壓力負荷小鼠心臟纖維化，血管周圍膠原蛋白含量顯著降低，這種膠原沉積的減少反映在心臟膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ mRNA水平的減少，雖然射血分數無差異，但是心臟舒張功能得到明顯改善[14]。

雖然5-AZA已獲監管部門批準用于血液系統惡性腫瘤的治療，但其在臨床腫瘤中的治療與多種副作用有關。這些不良反應包括胃腸道不適、體重減輕和骨髓抑制等。另有一項研究發現5-AZA 治療的4例腫瘤病例(既往有心血管疾病史)出現射血分數改變和心衰癥狀，但是該研究并未確定所報道的心臟不良事件是由5-AZA治療引起的還是與本身的疾病過程有關[15]。因為低劑量5-AZA比骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病患者的臨床給藥劑量低5倍，5-AZA對體重無影響，耐受性良好[14]。自發性高血壓大鼠經5-AZA治療后，血管周圍膠原蛋白水平也顯著降低，5-AZA處理的人心室心臟成纖維細胞膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和α-SMA表達減少[16]。此外，DNMT抑制劑RG108可以通過下調肌漿內質網Ca2+-ATP酶2α(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2α，SERCA2α)和β2-腎上腺素受體，減輕主動脈弓縮窄誘導的大鼠心肌纖維化[17]。CRISPR/Cas9介導的DNMT3A缺失小鼠在血管緊張素Ⅱ刺激后心功能進一步下降，心腎纖維化程度更嚴重[18]。在肺動脈高壓中，右心室成纖維細胞DNMT1表達上調，DNMT3A和DNMT3B無變化。右心室成纖維細胞通過DNMT1-HIF1α-丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)促進膠原合成和右心室纖維化。這種表觀遺傳線粒體代謝途徑也是一個潛在的抗纖維化治療靶點[19]?？傊?，上述研究結論并不一致，即使在壓力負荷誘導的心臟纖維化中，DNMTs各亞型的作用仍具有不確定性，而針對DNMTs的各種治療方法也成為潛在的候選者。

3.糖尿病性心肌?。禾悄虿∈切难芗膊∫粋€危險因素，糖尿病心肌病后期也存在嚴重的心臟纖維化。在一項糖尿病隨訪研究中，無論是糖尿病還是非糖尿病，心血管疾病的發生均與DNA甲基化有關，但兩者DNA甲基化修飾存在差異[20]。研究發現糖尿病心肌纖維化組織中DNMT1表達增加，然而DNMT3A和DNMT3B保持不變[21]。Tao等[22]研究也發現DNMT1在高糖誘導的心臟成纖維細胞中的表達增加，而且DNMT1介導的SOCS3啟動子高甲基化，導致SOCS3在糖尿病心肌纖維化中的表達下調，進而促進信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)活化，促進心臟成纖維細胞活化和膠原沉積。基因或藥理學失活的DNMT1逆轉心臟成纖維細胞的激活表型。

在糖尿病心肌病患者心臟中，同樣觀察到DNMT1與SOCS3表達水平負相關，DNMT1表達增加和SOCS3表達缺失。血清同型半胱氨酸濃度升高是糖尿病性心臟纖維化的危險因素，雄激素受體的DNMT1甲基化觸發了同型半胱氨酸誘導的心臟成纖維細胞自噬損傷。然而，也有研究顯示，在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病中，盡管心臟各細胞基因表達發生了顯著變化，但DNA甲基化仍保持穩定[23]。心臟外的甲基化也有可能參與糖尿病心肌病的發生、發展過程，超氧化物歧化酶模擬物B12通過調節肝臟DNMTs及SOCS 1/3來激活肝臟胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor-1，IGF-1)的產生以及抑制氧化應激，減少心臟纖維化面積，增強心臟保護作用[24]。以上研究說明，在糖尿病心肌病中，除了心臟的DNMTs直接參與心臟纖維化，其他器官的DNA甲基化也可能對心臟纖維化產生影響。

4.其他心血管疾?。涸谥嗵谴碳は?，心臟成纖維細胞焦亡相關蛋白Caspase 1和NLRP3以及DNMT1表達增加，lncRNA GAS5的DNMT1甲基化通過NLRP3導致心臟成纖維細胞焦亡[25]。阿霉素誘導的心臟損傷中，DNMT1的表達上調，使用CRISPR/cas9技術特異性敲除心臟DNMT1可改善心臟纖維化。DNA甲基化是生物衰老的強大決定因素，隨著年齡的增長，成年大鼠心臟中DNMT1表達明顯下調[26]。但有研究顯示,隨著年齡增長小鼠心臟成纖維細胞的甲基化狀態在14周齡之后沒有明顯變化，心臟成纖維細胞在增殖、膠原表達或DNA甲基化方面沒有表現出年齡依賴性的增加[27]。這說明年齡相關的心臟纖維化增加，不能直接歸因于成纖維細胞增殖的改變或ECM基因表達的增加。DNMTs參與各種心血管疾病的心臟纖維化，這為心臟纖維化的機制研究提供了更多見解。

三、DNMTs作為標志物及治療靶點的研究進展

DNMTs是心臟纖維化研究和治療中的一個新領域。DNA甲基化可用作疾病的生物學標志物。在一項全表觀基因組關聯研究中，729例心腦血管病患者血液樣本中存在特異性DNA甲基化改變。在急性心肌梗死患者的211個CpG位點上發現了不同的DNA甲基化，其中42例與心血管功能、心肌發育和缺血性損傷反應相關的基因有關[28]。盡管DNMTs抑制劑已獲批準用于不同器官的纖維化疾病，但將這些藥物用于治療心臟纖維化仍存在重大挑戰。5-AZA處理的小鼠DNMT1和DNMT3B基因表達顯著下調，而DNMT3A水平差異無統計學意義，但是5-AZA導致DNMT1和DNMT3B表達降低的機制尚不明確[14]。

肼苯噠嗪對心臟也具有保護作用，部分與抑制DNMT1活性有關，DNMT1活性可降低SERCA2a啟動子的甲基化程度，調節心肌細胞的鈣穩態。此外，肼苯噠嗪還能誘導TET3，促進RASAL1啟動子去甲基化[29]。因此，肼苯噠嗪可同時靶向DNMT和TET3，有潛力成為治療心肌纖維化的一種新的非核苷酸表觀遺傳藥物。CRISPR/Cas9是重要的基因編輯工具，在抗纖維化研究中，CRISPR/Cas9可用于恢復TET3的表達，以RASAL1和Klotho甲基化的啟動子為靶點減少纖維化[30]。總之，DNMTs不僅可作為心臟纖維化的生物學標志物，其抑制劑還可通過調控纖維化相關基因的甲基化發揮心臟保護作用。

四、展 望

綜上所述，DNMTs在心臟纖維化過程中參與了成纖維細胞的增殖和分化，以及ECM蛋白的產生和降解，為心臟纖維化的診斷和治療提供了新的策略。臨床研究已發現DNA甲基化與心血管疾病具有相關性，提示DNMTs可能作為心臟纖維化的診斷和預后指標。心臟纖維化目前尚無有效的治療方法，DNMTs各亞型在心臟纖維化中發揮不同的作用，相關具體機制仍需進一步探索。雖然DNMTs同時具有促纖維化和抗纖維化作用，但是DNMTs抑制劑對心臟纖維化始終產生有益作用，其作用機制仍不明確，也許開發針對DNMTs亞型的特異性抑制劑是另一治療心臟纖維化的有效方法?？偠灾訢NA甲基化過程尤其是DNMTs作為靶點在心臟纖維化及心血管疾病中具有巨大的潛力，相關領域的研究也越來越多，經過不斷地探索研究，相信能夠在理解心血管疾病發生機制及其治療方法中，發揮重要作用。