長鏈非編碼RNA ZEB2-AS1在非小細胞肺癌中的表達及臨床病理特征與預后的關系

杜進臣 聶洪鑫 胡尕偉 張 斌 王占鵬 李慶新

肺癌是當前世界范圍內發生率最高的惡性腫瘤，且發生率與致死率仍在繼續上升[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌病例的近80%。肺腺癌和肺鱗癌是NSCLC的兩種主要組織學類型，而肺腺癌已成為近年來最常見的NSCLC組織學類型[2]。盡管近年來臨床不斷探尋新的治療方法，但NSCLC患者的總生存率僅為15%左右[3]。因此，深入地了解NSCLC的潛在發病機制，尋找早期診斷及治療NSCLC靶標基因來提高NSCLC患者的生存率已成為研究重點。長鏈非編碼核糖核酸(long non-coding RNA，lncRNA)在轉錄、翻譯或翻譯后修飾等多種生物學過程中發揮重要作用，并參與細胞的增殖、凋亡和代謝等生理過程[4,5]。目前已在多種惡性腫瘤中發現了異常的lncRNA表達，其在不同類型的癌癥中作為原癌基因或抑癌基因發揮調控作用[6]。鋅指E盒結合同源盒蛋白2-反義RNA 1(zinc-finger E-box binding homeobox 2-antisense RNA1，ZEB2-AS1)是一種新發現的lncRNA。越來越多的研究表明,lncRNA ZEB2-AS1參與、促進多種惡性腫瘤的發生和發展過程，包括胰腺癌、結腸癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌和肝細胞癌等[7～17]。而關于lncRNA ZEB2-AS1在NSCLC中的表達研究少有報道。本研究通過觀察lncRNA ZEB2-AS1在NSCLC患者中表達，并分析其表達與患者臨床病理特征及預后關系，以期為NSCLC早期診斷及靶向治療提供理論依據。

材料與方法

1.患者與組織樣本：選取2013年1月～2018年3月在中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院普胸外科行外科手術治療的非小細胞肺癌患者129例，其中男性79例，女性50例，患者平均年齡為62.41±6.13歲。納入標準：①所有NSCLC患者術前均未接受新輔助化療/放療或免疫治療；②具有NSCLC手術指征，無手術相關禁忌證；③術后病理報告明確證實為NSCLC。排除標準：①臨床病歷資料不完整；②合并其他惡性腫瘤；③生存時間<3個月；④心臟、腎臟等器官嚴重損傷者。收集所有患者的肺癌組織和癌旁正常組織，且皆為手術切除新鮮標本，液氮快速冰凍后于-80℃低溫保存。根據世界衛生組織對惡性腫瘤的分類，由兩名病理學專業醫師對所有NSCLC患者的診斷和病理分期進行組織病理學證實。收集患者的臨床病理資料主要包括腫瘤分化程度、T分期、淋巴結轉移、TNM分期，以及患者一般資料包括年齡、性別、吸煙史等。NSCLC的臨床病理分期，參照美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM 分期系統。隨訪數據使用醫院電子病歷系統和電話采訪進行。本研究已通過中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院醫學倫理學委員會審批(倫理審批號：2021KYLL069)，所有患者均被告知并獲得書面同意。

2.方法：取-80℃保存標本約50mg在勻漿機勻漿后，按照TRIzol試劑(購自美國Invitrogen公司)的說明書，從NSCLC組織及癌旁正常肺組織中提取總RNA。參照反轉錄試劑盒(購自北京智杰方遠)將RNA反轉錄為cDNA，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法檢測lncRNA ZEB2-AS1相對表達量(PCR儀購自賽默飛世爾科技有限公司)。lncRNA ZEB2-AS1以GAPDH為內參基因，引物均由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成。采用2-ΔΔCT法計算NSCLC患者癌組織及其癌旁組織中lncRNA ZEB2-AS1相對表達量。lncRNA ZEB2-AS1上游引物: 5′-ATG AAGAAGCCGCGAAGTGT-3′，下游引物: 5′-CACACCCTAATACACATGCCCT-3′；GAPDH上游引物: 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物: 5′-TCCACCCTGTTGCTGTA-3′。

3.隨訪：術后對所有NSCLC患者進行隨訪，末次隨訪時間為2020年5月1日，統計總生存時間，并繪制Kaplan-Meier生存曲線。

結 果

1.NSCLC組織及其癌旁組織中lncRNA ZEB2-AS1表達水平檢測結果：通過qRT-PCR檢測了129例NSCLC組織和癌旁肺組織中lncRNA ZEB2-AS1的表達水平(圖1)。NSCLC組織中lncRNA ZEB2-AS1表達水平顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.001)。NSCLC組織中lncRNA ZEB2-AS1表達的中位數為4.36，將129例NSCLC患者分為低表達組(<4.36，n=68)和高表達組(≥4.36，n=61)。

圖1 NSCLC組織和癌旁正常肺組織中lncRNA ZEB2-AS1的相對表達水平

2.根據lncRNA ZEB2-AS1表達水平的分組：分析NSCLC組織中lncRNA ZEB2-AS1表達水平與患者臨床病理特征的關系，lncRNA ZEB2-AS1表達水平與NSCLC患者腫瘤分化程度(χ2=9.157，P=0.004)、淋巴結轉移(χ2=4.372，P=0.003)和TNM分期(χ2=23.155，P<0.001)顯著相關，而與性別、年齡、吸煙史、T分期之間無顯著關聯(P>0.05)，詳見表1。

表1 NSCLC患者lncRNA ZEB2-AS1的相對表達量與其臨床病理特征的關系

3.NSCLC組織中lncRNA ZEB2-AS1的表達水平與患者預后的關系：Kaplan-Meier生存分析數據顯示，lncRNA ZEB2-AS1高表達組的總生存率顯著低于低表達組(P=0.013，圖2)。多因素COX比例風險模型分析均顯示，lncRNA ZEB2-AS1表達水平與NSCLC患者的總生存率獨立相關(HR=1.925，95% CI：1.472～10.663，P=0.036，表2)，表明lncRNA ZEB2-AS1高表達提示NSCLC患者臨床預后不佳。此外，多因素COX比例風險模型顯示分化程度、淋巴結轉移、TNM分期也與NSCLC患者預后有關(P<0.05)。

圖2 lncRNA ZEB2-AS1高表達組和低表達組Kaplan-Meier生存曲線lncRNA ZEB2-AS1高表達組的總生存期與lncRNA ZEB2-AS1低表達組比較，P=0.013

表2 NSCLC患者預后的COX單因素和多因素回歸分析

討 論

肺癌是目前世界范圍內癌癥相關死亡的主要原因[18]。盡管近年來在NSCLC臨床診治方面已取得了卓越的研究成果，但NSCLC早期的臨床癥狀隱匿，缺乏高效的篩查手段，診療效果仍不能令人滿意。因此，如何早期診斷并預測預后對于NSCLC的臨床治療尤為重要。有研究者發現人體近98%的基因組都將被轉錄為lncRNA，而只有約2%的RNA被編碼為蛋白質[19]。越來越多的研究證據表明，lncRNA在調控人類癌癥的發生和發展過程中發揮重要作用，并在NSCLC在內的不同腫瘤中充當原癌基因或抑癌基因[20]。人體組織或血漿中lncRNA的表達水平可用于多種惡性癌癥的早期診斷和預后評估。因此，探尋更精準的lncRNA，對某些惡性腫瘤的早期診斷與靶向治療具有重要的臨床價值。

lncRNA ZEB2-AS1是近年來被探尋的新型lncRNA，最早由Zhuang等[21]在膀胱癌的研究中鑒定發現的。Jiang等[22]研究發現，lncRNA ZEB2-AS1在結直腸癌組織和細胞中均呈高表達，促進結直腸癌細胞的增殖及遷移，其研究結果顯示lncRNA ZEB2-AS1可顯著抑制癌細胞發生上皮間質轉化。該實驗還發現lncRNA ZEB2-AS1的表達與微小RNA-1025(microRNA-1025，miR-1205)的表達呈負相關，CRKL(CT10 oncogene homolog-like)可能是miR-1205的直接靶點，lncRNA ZEB2-AS1通過調節miR-1205/CRKL通路來促進結直腸癌細胞發生上皮間質轉化[21]。

Xu等[9]研究發現，lncRNA ZEB2-AS1在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且lncRNA ZEB2-AS1高表達的患者預后較差，表明在胃癌細胞中lncRNA ZEB2-AS1高表達可促進癌細胞增殖與侵襲，并抑制癌細胞的凋亡[9]。Wu等[14]研究發現lncRNA ZEB2-AS1在膀胱癌組織和細胞中也呈高表達，與膀胱癌組織中微小RNA-27b(miR-27b)表達顯著負相關(r=0.1688，P<0.05)，lncRNA ZEB2-AS1可通過下調miR-27b表達進而促進膀胱癌細胞增殖。Lan等[15]通過實驗發現，與癌旁的正常組織比較，肝癌組織中lncRNA ZEB2-AS1的表達水平更高，而lncRNA ZEB2-AS1的表達還與原發腫瘤的大小、肝內轉移、淋巴結轉移相關。該實驗中Kaplan-Meier生存曲線顯示，與lncRNA ZEB2-AS1低表達水平的患者比較，lncRNA ZEB2-AS1高表達肝癌患者的總體生存率和無復發生存率較低。通過調節上皮間充質轉化誘導的標志物表達水平，lncRNA ZEB2-AS1的下調可抑制肝惡性腫瘤的生長和轉移，可考慮將lncRNA ZEB2-AS1作為肝癌患者早期診斷的腫瘤標志物。

而關于lncRNA ZEB2-AS1在肺癌中的研究卻鮮有報道。Guo等[17]研究發現，lncRNA ZEB2-AS1在人肺癌組織中顯著上調，而lncRNA ZEB2-AS1能夠促進人肺癌細胞的增殖并抑制其凋亡。有研究發現白細胞介素-6(interleukin 6, IL-6)在非小細胞肺癌中上調，并通過激活STAT1/ ZEB2-AS1通路促進了非小細胞肺癌的進展[23]。然而，少有研究探討lncRNA ZEB2-AS1在NSCLC中的臨床意義和預后價值。本研究通過qRT-PCR檢測了129例非小細胞肺癌組織和匹配的癌旁肺組織中lncRNA ZEB2-AS1的表達水平。筆者發現與相匹配的癌旁肺組織比較，lncRNA ZEB2-AS1在NSCLC組織中的表達水平顯著升高，這表明lncRNA ZEB2-AS1可能調控了NSCLC的發生。筆者探討了lncRNA ZEB2-AS1表達與129例NSCLC患者的臨床病理特征之間相關性。本研究結果表明，lncRNA ZEB2-AS1表達水平與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM分期顯著相關。Kaplan-Meier生存分析數據顯示，lncRNA ZEB2-AS1高表達組的總生存期明顯低于低表達組。單因素和多因素COX比例風險模型分析均顯示lncRNA ZEB2-AS1的表達與NSCLC患者的整體生存獨立相關，這表明lncRNA ZEB2-AS1可能是NSCLC患者的整體生存的獨立預后因素，這與Xu等[24]的研究結果一致。

總之，筆者研究發現，ZEB2-AS1在NSCLC組織中表達水平較高，并且其高表達與NSCLC中的腫瘤進展和不良預后相關，ZEB2-AS1可能成為新的NSCLC患者預后判斷的分子標志物及潛在的治療靶點。