lncRNA CoroMarker在冠心病患者中的表達差異及意義

楊 毅 張莉晶 孫龍飛 姜海兵

近年來隨著疾病診斷技術及國民經濟水平的提升，越來越多的健康問題被揭示。我國目前有冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAD)患者1100余萬，其發生率及病死率仍處于上升階段[1]。雖然CAD的診療手段層出不窮，但仍無法早期準確判斷其發病，因此，尋找新診療靶點極其重要。近年來，研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)參與調控細胞眾多生理、病理環節，并且在心血管疾病方面發揮著重要作用。lncRNA是一類不編碼蛋白質的特殊RNA，長度超過200個核苷酸。研究證實，lncRNA H19和LIPCAR血漿水平的升高與CAD風險增加相關[2]。Xu等[3]研究發現，與對照組比較，CAD患者lncRNA IFNG-AS1呈現高表達狀態，與患者血清TNF-α、IL-1、IL-6、hs-CRP等炎性因子水平呈正相關。此外，Cai等[4]研究發現CAD患者lncRNA CoroMarker在外周血單核細胞中的表達水平明顯升高。

本課題組在前期的預實驗中再次驗證lncRNA IFNG-AS1在CAD患者中呈現高表達。此后在后期擴大實驗中進一步檢測了該lncRNA及另外兩種文獻報道與CAD炎癥密切相關的lncRNA AF131217.1以及lncRNA CoroMarker，并觀察是否上述lncRNA與IL-6、TNF-α的血清水平相關，探討上述3種lncRNA可否作為CAD新的診斷指標，及其與冠張動脈粥樣硬化的炎性反應的作用及意義。

對象與方法

1.研究對象：入選2019年3月～2020年9月在新疆醫科大學附屬中醫醫院行擇期冠狀動脈造影符合 CAD診斷標準的患者共40例作為病例組，同時入選同期造影正常者作為對照組，共40例。所有患者簽署知情同意，研究通過筆者醫院醫學倫理學委員會批準。納入標準：年齡20～80歲，行冠狀動脈造影明確或為冠心病或明確為冠狀動脈正常患者。排除標準:①其他冠狀動脈病變；②心臟瓣膜病、心肌病等其他心臟病變；③急性炎癥性疾病；④免疫系統疾病。

2.CAD診斷標準:擇期冠狀動脈造影，診斷符合中華醫學會心血管病學分會制定的慢性穩定性心絞痛診斷與治療指南，即任一心外膜冠脈血管直徑狹窄超過50%且有心絞痛或無創性檢查顯示患者有心肌缺血證據者[5]。

3.觀察指標：(1)患者入組時一般特征，包括性別、年齡、體重指數(body mass index,BMI)、是否吸煙、低密度脂蛋白、合并癥等情況。(2)外周血IL-6、TNF-α水平。(3)外周血單核細胞中lncRNA IFNG-AS1、lncRNA AF131217.1和lncRNA CoroMarker表達水平。

4.主要試劑和儀器：AU689 全自動生化分析儀(美國BechmauConlter公司)；PCR擴增引物(新疆歐易生物科技有限公司)合成；RT-PCR儀(美國Applied Biosystems公司，儀器型號：MasterMix-LR/1051845151001)；反轉錄試劑盒及RT-PCR試劑(北京艾可莘生物科技優秀公司)。

5.實驗內容:手術當日，晨起采集空腹靜脈血4ml于EDTA抗凝管中，控溫離心機4℃、3000r/min離心血液樣本10min，上層血漿樣本檢測低密度脂蛋白膽固醇及IL-6、TNF-α；離心下層提取單核細胞中的RNA，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測外周血單核細胞中lncRNA IFNG-AS1、lncRNA AF131217.1和lncRNA CoroMarker。

6.實驗步驟：(1)RNA提取步驟及反轉錄:分離PBMC樣本，使用Trizol法提取RNA，用RNase free的水溶解沉淀。核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度，瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。按照反轉錄試劑盒說明：各樣品均取800ng RNA，隨機引物(0.1μg/μl)1μl，2×SYBR Green PCR Master Mix 10μl，TransScript@RT/RI Enzyme Mix 1μl補DDW至20μl；65°水浴5min后迅速至冰上，加入5X緩沖液4μl，RNA酶抑制劑1μl，RT 1μl，DNTP 2μl 42℃孵育1h 70℃孵育5min后冰上冷卻即完成反轉錄。(2)RT-PCR法檢測PBMC中IFNG-AS1、AF131217.1及CoroMarker表達情況，通過Genebank中IFNG-AS1、AF131217.1、CoroMarker序列，使用primer 6.0軟件設計引物(表1)。

表1 實驗用PCR引物序列及擴增片段大小

結 果

1.一般資料比較:病例組40例，其中男性32例，女性8例，患者年齡56.4±6.5歲；對照組40例，其中男性30例，女性10例，患者年齡57.8±5.9歲。兩組患者在性別、年齡、體重指數(BMI)、吸煙、低密度脂蛋白、合并癥等方面比較，差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

表2 兩組患者一般臨床資料比較

2.兩組IL-6、TNF-α比較：IL-6病例組2.91±0.33pg/ml，高于對照組1.07±0.10pg/ml(P<0.05)，TNF-α病例組46.31±1.81pg/ml，高于對照組34.18±1.04pg/ml(P<0.05,表3)。

表3 兩組患者分析指標比較

3.兩組患者行冠脈造影術前服藥對比:病例組及對照組在抗血小板藥物(包括阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛、吲哚布芬)、倍他受體阻滯劑(β-blocker)、他汀(Statin)、鈣拮抗劑(CCB)、血管緊張素轉化酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ACEI/ARB)使用情況組間比較，差異無統計學意義(P>0.05，表4)。

表4 兩組患者用藥情況對比[n(%)]

4.lncRNA表達:qRT-PCR表明，CAD病例組患者lncRNA IFNG-AS1、lncRNA AF131217.1的表達水平與對照組比較，無明顯增高，差異無統計學意義(P>0.05)，lncRNA CoroMarker表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 3種lncRNA 在病例組與對照組PBMC中的表達

5.ROC曲線結果:lncRNA IFNG-AS1的AUC為0.360，lncRNA AF131217.1的AUC為0.445，在本研究中對冠心病不具有診斷意義。lncRNA CoroMarker的AUC為0.960，標準誤為0.026，95%CI：0.908～1.000(P=0.000)，同時結果還顯示lncRNA CoroMarker診斷CAD敏感度和特異性分別為90.0%和90.0%，cut-off值為1.081，詳見圖2。

圖2 3種lncRNA診斷CAD的ROC曲線

6.CAD組lncRNA CoroMarker與IL-6、TNF-α相關性分析：CAD組外周血單核細胞中lncRNA CoroMarker與血漿IL-6呈線性正相關(r=0.437，P=0.005)，與血漿TNF-α呈線性正相關(r=0.740，P=0.000)，詳見圖3。

圖3 觀察組lncRNA CoroMarker與IL-6、TNF-α相關性比較

討 論

冠心病危險因素眾多，除了血脂異常、高血糖、高血壓、肥胖、吸煙等，也與炎性損傷及炎性介質密切相關，IL-6、TNF-α是傳統炎性標志物，與冠心病的發生、發展關系密切[6～8]。本研究發現CAD患者IL-6、TNF-α明顯高于對照組，說明IL-6、TNF-α在動脈硬化發生、發展中有重要的作用。但傳統炎性標志物與長鏈非編碼RNA有無相關性，具體如何影響，目前仍不明確。

lncRNAs參與調控細胞眾多生理、病理環節，前述研究發現CAD患者lncRNA IFNG-AS1、lncRNA AF131217.1、lncRNA CoroMarker明顯升高[2～4]。李文杰等[9]研究發現，冠心病患者血清lncRNA UCA1在老年冠心病患者中低表達，且與低密度脂蛋白膽固醇、Gensini評分、預后情況有關。張浩等[10]研究發現，冠脈介入術后再狹窄組患者血清lncRNA MIR155HG表達水平明顯升高，與Gensini評分呈正相關，對冠心病患者PCI后冠狀動脈再狹窄具有一定診斷價值。李孟婷等[11]研究顯示lncRNA TUG1可能通過改變炎性因子表達水平從而影響血管內皮細胞功能,參與冠心病的發生、發展過程。可見lncRNAs參與冠心病的機制比較復雜。同時更有研究顯示在服用氯吡格雷作為冠心病二級預防用藥的患者中，lncRNA表達的差異與患者氯吡格雷抵抗及患者的長期預后相關[12]。

本研究中lncRNA IFNG-AS1、lncRNA AF131217.1沒有發現明顯的高表達，可能與研究樣本量較小、研究入選人群不同、合并疾病與相關研究不同有關。本研究發現觀察組患者lncRNA CoroMarker明顯高于對照組，與既往研究結果一致[13]。lncRNA CoroMarker診斷冠心病的AUC為0.960,標準誤為0.026，95%CI為0.908～1.000(P=0.000)。CoroMarker診斷CAD敏感度和特異性分別為90.0%和90.0%，cut-off值為1.081。在相關性分析中發現，患者IL-6、TNF-α隨著lncRNA CoroMarker的升高而升高，呈現線性正相關(r=0.437，P=0.005)。考慮lncRNA CoroMarker可能通過炎性通路影響了IL-6、TNF-α的表達，促進了CAD患者的發生、發展，具體機制需要進一步研究。

綜上所述，在CAD患者血清單核細胞中lncRNA CoroMarker差異性高表達，對CAD的診斷具有較高的敏感度及特異性，具有成為診斷CAD及評估病情嚴重程度的生物學標志物的潛能，與IL-6、TNF-α水平呈線性正相關，考慮lncRNA CoroMarker通過炎性通路促進CAD的發生、發展。