阻塞性睡眠呼吸暫停大鼠海馬區HMGB1、TLR4、NF-κB的變化

劉仁帥 羅 憫 殷 梅

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)是一種非常常見的睡眠障礙性疾病，其患者因長期慢性間歇性缺氧及神經炎癥導致皮層和海馬神經元細胞慢性損傷甚至細胞凋亡，并最終導致神經認知功能障礙[1～3]。目前關于OSAS致海馬損傷的具體作用機制尚未明確。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一種高度保守的核DNA結合蛋白和損傷相關分子模式的分子[4]。其主要存在于細胞核中，參與核小體穩定、細胞分化、DNA修復和基因轉錄中。當細胞受到“危險信號”刺激時，作為警報蛋白家族的分子HMGB1會被迅速激活并釋放到細胞外。它直接作為炎性細胞因子啟動和維持免疫反應，并保持受損組織的體內平衡[5]。

Toll樣受體4(toll-like receptor，TLR4)是哺乳動物模式識別受體家族的一員，被認為是將細胞外抗原識別信息傳遞給細胞并觸發炎性反應的關鍵跨膜蛋白[6]。TLR4通過識別外部病原體和調節下游炎癥級聯反應來保護宿主細胞[7]。最近的研究表明，TLR4在OSAS大鼠的炎癥啟動和器官損傷中起著至關重要的作用，而TLR4可以激活細胞間核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路[8，9]。本研究通過建立OSAS大鼠模型，探討慢性間歇性缺氧對海馬組織的病理損傷及HMGB1、TLR4、NF-κB的表達變化，以期為OSAS認知障礙的治療尋找藥物干預的潛在靶點。

材料與方法

1.實驗動物及主要試劑：健康SD雄性大鼠60只，體質量280～320g，購自昆明醫科大學實驗動物學部[生產許可證：SCXK(滇)K2015-0002)]，在昆明醫科大學實驗動物樓標準化飼養，本實驗得到昆明醫科大學動物倫理學委員會批準。10mg/ml玻璃酸透明質酸鈉凝膠購自上海其勝生物制劑公司，HRP標記通用型二抗購自美國Cell Signaling Technology公司，β-actin抗體購自艾比瑪特生物醫藥(上海)有限公司，DBA顯色試劑盒、封閉用正常羊血清、通用型二步法檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；HMGB1、TLR4、NF-κB/P65抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司。

2.動物造模及分組：60只SD大鼠按隨機數字表法分為對照組和模型組，每組各30只。對照組正常飼養，不做處理。模型組大鼠通過咽腔多點注射醫用透明質酸鈉凝膠方法制備OSAS大鼠模型，具體造模方法參照周趙德等[10]，步驟如下：(1)所有大鼠適應性飼養1周后，使用多參數神經監護儀監測實驗組大鼠的血氧飽和度并記錄數據。(2)模型制備方法：腹腔麻醉后，大鼠開口器暴露咽腔，多點少量注射醫用透明質酸鈉凝膠(約3ml)，觀察大鼠呼吸情況。監測大鼠生命體征，避免窒息死亡。分別于術前1周及術后4周使用多參數神經監護儀監測最低血氧飽和度及平均血氧飽和度，并進行統計學分析。(3)實驗分組：30只模型組大鼠，待造模成功后，按繼續飼養時間分為實驗2、4、6周組，每組各10只，與對照組相對應。

3.標本提取及制作：行為學評定后，每組取2只大鼠給予3ml/kg 10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉，起效后行心臟灌注，再用4%的多聚甲醛溶液固定后，切下海馬組織，石蠟包埋，備用HE及IHC。每組取2只大鼠同樣上述方法麻醉后，新鮮海馬組織被分離并儲存在-80℃。

4.HE染色檢測海馬CA1區神經細胞形態學變化：根據標準方案，將海馬切片在二甲苯中脫蠟，通過分級乙醇再水化，并用HE染色。在光學顯微鏡下觀察病理變化。

5.免疫組化檢測海馬CA1區HMGB1、TLR4、NF-κB/P65蛋白的陽性表達：切片用二甲苯脫蠟并用乙醇水化，在4℃下用一抗孵育過夜。切片在PBS中沖洗3次，每次5min，5%羊血清封閉，25℃，1h，分別加入滴加PV9000 試劑(聚合物輔助劑)、滴加PV9000試劑(酶標羊抗小鼠/兔)孵育，PBS液中漂洗后DBA顯色。應用Image-Pro Plus 6.0軟件測定蛋白質的積分吸光度(A)值。

6.Western blot法檢測HMGB1、TLR4、NF-κB/P65蛋白的表達：大鼠海馬灌注取材后，每100mg組織中加入500μl的RIPA裂解液(含50μl蛋白酶抑制劑)，充分剪碎組織后，冰浴環境下超聲細胞破碎儀勻漿20s，冰浴上靜置20min。4℃高速離心機下，12000r/min離心10min，收集上清液。通過BCA蛋白質測定試劑測量蛋白質濃度。組裝電泳裝置，調整各個樣品的蛋白上樣量均為80μg,每管加入3μl 6×loading buffer，吹打混勻，于沸水中變性10min。瞬時離心5s，4℃短暫保存，-20℃長期保存。用SDS-PAG電泳分離后轉移至PVDF膜上。在室溫下封閉液阻斷30min后分別加入用TBST(含0.1%Tween20的Tris-緩沖鹽水)稀釋的小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1∶1000)(內參)、兔抗大鼠HMGB1單克隆抗體(1∶1000)、兔抗大鼠TLR4單克隆抗體(1∶1000)、小鼠抗大鼠NF-κB/P65單克隆抗體(1∶2000)，4℃孵育過夜。AB液化學發光，Live aquire采集圖像。

結 果

1.造模成功判斷：造模后實驗組大鼠出現呼吸費力、精神不振、活動減少、抬頭呼吸、反應遲鈍。而正常實驗飼養組大鼠性情溫順、呼吸正常、精神良好、反應敏捷。對造模前后最低血氧飽和度及平均血氧飽和度指標相比較，顯示造模后上述指標降低，差異均有統計學意義(P<0.05),詳見表1。

表1 OSAS大鼠造模前后最低血氧飽和度和平均血氧飽和度

2.大鼠海馬CA1區HE染色：正常2、4、6周組海馬CA1區神經元細胞分布及染色均勻，排列整齊，形態結構正常，核仁清晰；而對照組神經元細胞排列紊亂，結構稀疏，核仁模糊不清，核固縮、裂解，且隨著2、4、6周組時間逐漸延長，上述表現更為明顯，詳見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CA1區病理學變化(HE，50μm，×40)

3.各組大鼠海馬CA1區HMGB1及TLR4蛋白的免疫組化結果：可見實驗2、4、6周組HMGB1及TLR4蛋白平均吸光度值與對照組對應2、4、6周組比較表達量升高，染色加深，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖2、圖3，表2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區HMGB1表達(免疫組化，50μm，×40)與對照組比較，*P<0.05

圖3 各組大鼠海馬CA1區TLR4表達(免疫組化，50μm，×40)與對照組比較，*P<0.05

表2 各組大鼠海馬CA1區HMGB1、TLR4表達的平均吸光度值

4.各組大鼠海馬HMGB1、TLR4及NF-κB/P65蛋白的Western blot法檢測結果：可見以上各蛋白在各組大鼠海馬組織中均有所表達。實驗2、4、6周組HMGB1、TLR4、NF-κB/P65的表達與對應對照組各期比較均明顯增加(P<0.05)，詳見圖4。

圖4 各組海馬組織中HMGB1、TLR4及NF-κB/P65蛋白表達結果條帶所示1、2、3、4、5、6分別對應對照2、4、6周組和實驗2、4、6周組，與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

目前，國內外鮮有關于OSAS致海馬損傷有關機制的研究。有關數據表明，OSAS影響約9%～38%的成年人，且其發生率隨年齡增長而增加[11]。作為OSAS的常見并發癥，認知障礙近年來備受關注。OSAS對認知功能的影響包括注意力和警覺性降低、記憶力和學習能力受損、精神運動功能失衡、情緒調節紊亂及執行功能下降等[12,13]。海馬體是顳葉內側的一個結構，在空間導航和情景記憶中起著關鍵作用。其由功能等效的主神經元的同質種群組成。然而，海馬主細胞群內的異質性，特別是CA1區錐體細胞表現出顯著的異質性[14,15]。因此，本研究通過HE染色觀察OSAS大鼠及對照組大鼠海馬CA1區神經元變化。研究發現OSAS組較對照組出現明顯的神經細胞損傷變化。研究表明，慢性間歇性缺氧不止導致海馬CA1區受損，同時也會引起額葉皮質損傷。海馬體和前額葉皮質在反映學習相關連貫性的變化時有共同的功能網絡運行，也就是說，學習過程中策略的轉變同時反映在兩個區域的空間激發模式中[16]。有研究者運用透射電子顯微鏡及TUNEL法觀察及測定OSAS大鼠海馬及前額葉皮質的超微結構變化及凋亡細胞的陽性表達，證實OSAS大鼠引起海馬及額葉皮質細胞凋亡[17]。

OSAS中的缺氧和氧化應激可能直接導致細胞損傷，受損細胞和細胞外基質可能會釋放蛋白質和核酸的分解產物，作為“危險信號”，稱為DAMP。HMGB1作為最重要的代表DAMP，備受關注。它是一種普遍存在的高度保守的核蛋白，在哺乳動物細胞中含量豐富，從壞死的細胞核轉移到細胞質，然后釋放到細胞外基質[18]。HMGB1可能通過與RAGE、TLR4和TLR2結合來促進炎癥。炎性損傷導致額外的DAMP被釋放，刺激進一步的炎性反應。TLR4是最早發現的HMGB1受體，屬于免疫球蛋白超家族跨膜受體，廣泛表達于多種免疫細胞和內皮細胞，以及其他細胞表面。NF-κB是一種轉錄因子，已被發現參與多種細胞功能，包括造血、炎癥、免疫反應、細胞凋亡，此外，NF-κB與c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路具有復雜的相互關系，已被證明可調節神經元細胞中多種促炎性細胞因子的產生，包括 TNF-α、IL-6 和 IL-1β。與各自的配體結合，這些受體可通過NF-κB易位誘導細胞內信號轉導并介導炎性反應[19]，參與細胞凋亡過程。本實驗中OSAS大鼠模型組HMGB1、TLR4、NF-κB均較對照組有明顯表達。已有研究通過TLR2基因敲除大鼠證實TLR2參與CIH誘導的認知缺陷的機制，TLR2基因敲除大鼠較正常對照組認知障礙減輕[20]。阿托伐他汀對慢性間歇性缺氧所致海馬神經元損傷的療效：涉及TLR4及其下游信號通路。

越來越多的證據表明OSAS與海馬損傷之間存在密切關聯，但分子機制尚不明確。如果確定了核心分子機制，并將其核心參與者用作干預目標，它可能在預防和控制 OSAS相關認知障礙中發揮重要作用。HMGB1、TLR4及NF-κB 信號因子在海馬組織中的表達增加表明慢性間歇性缺氧可能激活該途徑，這可能在缺氧引起的海馬神經炎性損傷中起關鍵作用。