JMJD3和CD163在乳腺癌中的表達及其臨床意義

呂 娟 呂珊妹 董學君

乳腺癌的發生率在女性惡性腫瘤中居首位，是女性癌癥死亡的主要原因[1]。盡管現有的篩查方法和治療手段已顯著改善了乳腺癌的預后，但仍有眾多患者死于耐藥和轉移[2]。因此，尋找乳腺癌發生、發展的機制和根源，確定新的治療靶點，尋求新的干預策略對于提高乳腺癌的療效和預后具有重要意義。巨噬細胞來源于血液循環系統中的單核細胞，在不同的環境或信號刺激下發生不同性質的活化，產生兩種不同的類型，包括經典活化的巨噬細胞(M1型巨噬細胞)和替代活化的巨噬細胞(M2型巨噬細胞)。腫瘤組織中的巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)主要為M2型巨噬細胞，TAMs在乳腺癌組織中占間質細胞的50%～80%，乳腺癌的不良預后與TAMs的浸潤密切相關[3]。CD163常作為M2巨噬細胞的標志物。JMJD3(jumonji domain-containing protein 3)是含JmjC結構域組蛋白去甲基化酶家族成員之一，它可以特征性地降低組蛋白H3K27me2(dimethylation of histone H3 lysine 27)和H3K27me3(trimethylation of histone H3 lysine 27)的甲基化水平，從而上調基因的表達，在細胞的分化、衰老、胚胎發育及腫瘤發生、發展等生理活動中有著重要的作用[4]。JMJD3在乳腺癌中的表達，以及JMJD3與M2型巨噬細胞之間的關系，目前報道較少。本研究收集了47例乳腺癌組織標本，利用免疫組化法檢測了乳腺癌組織中JMJD3和CD163的表達，并分析了其與乳腺癌臨床病理特征的相關性，以豐富對乳腺癌發生、發展機制的認識。

對象與方法

1.病例資料:收集紹興市人民醫院2015年1月～2016年12月收治的乳腺癌術后癌組織和癌旁組織石蠟標本47對，并收集相關臨床資料，所有標本均經知情同意，并經筆者醫院醫學倫理學委員會審核。患者術前均未接受化療或放療。按照2012年WHO乳腺癌組織病理分級分類法對其進行分組。所有標本均經紹興市人民醫院病理科確診。

2.主要試劑：anti-JMJD3兔抗人多克隆抗體(ab38113)、anti-CD163兔抗人單克隆抗體(ab182422)購自英國Abcam公司。二抗及二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

3.免疫組織化學染色:主要步驟如下：石蠟標本經切片、烤片、脫蠟和水化；封閉內源性過氧化物酶；檸檬酸鈉溶液煮沸，進行抗原修復暴露抗原決定簇；5%羊血清室溫30min，封閉非特異性蛋白；一抗37℃孵育2h；二抗孵育30min；DAB顯色3～10min；蘇木精復染1～2min；脫水，中性樹脂封片。

4.免疫組化結果判斷:JMJD3的陽性信號為棕褐色顆粒狀，主要位于乳腺癌組織的細胞核內。JMJD3結果判定：①依據標本的染色程度：陰性0分，淡黃色1分，淺褐色2分，深褐色3分；②依據陽性細胞數量：陽性細胞總數在0～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。兩者相加，總分在1～3分為低表達組，4～7分為高表達組。CD163在組織切片中定位于巨噬細胞的細胞膜，胞質也有著色，陽性細胞呈巢狀分布于乳腺癌癌間質，亦有呈星形散在浸潤于乳腺癌癌巢。CD163結果判定：首先在低倍鏡下選取視野中巨噬細胞最密集的5個區域，在高倍鏡下(×400)計數，最后取5個視野總和的平均值進行統計。

5.統計學方法：采用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行統計分析，JMJD3在乳腺癌中的表達與病理特征之間的關系采用χ2檢驗，CD163在乳腺癌中的表達與病理特征之間的關系采用t檢驗，CD163與JMJD3之間的相關性分析采用Spearman相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.乳腺癌組織中JMJD3與CD163的表達:JMJD3主要在乳腺癌組織中表達，主要定位于細胞核，在乳腺癌組織中呈棕褐色，在乳腺癌中的陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(P=0.000)，詳見圖1。CD163主要定位于乳腺癌組織間隙，呈巢狀分布，亦有星形散在浸潤于乳腺癌癌巢組織，在乳腺癌中的陽性表達數102.6±52.3，明顯高于癌旁組織29.7±9.6，差異有統計學意義(P=0.000)，詳見圖1。

圖1 免疫組化檢測JMJD3和CD163在乳腺癌及癌旁組織中的表達情況(免疫組化，×400)

2.JMJD3和CD163與乳腺癌臨床病理特征之間的關系：在乳腺癌組織中，JMJD3與乳腺癌的TNM分期呈正相關，TNM分期越高，JMJD3的表達量越高(P=0.012)；JMJD3表達量與雌激素受體(estrogen receptor, ER)(P=0.032)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)(P=0.005)表達有關，ER、PR表達陰性的患者，JMJD3的表達更高；JMJD3的表達與淋巴結轉移有關，發生淋巴結轉移的患者JMJD3表達更高(P=0.000)，詳見表1。在乳腺癌組織中，CD163的表達與TNM呈正相關(P=0.014)，與PR陰性表達有關(P=0.001)，并且與淋巴結轉移有關(P=0.001)，詳見表1。

表1 乳腺癌組織JMJD3和CD163表達與腫瘤特征的關系

3.乳腺癌中JMJD3與CD163的相關性分析:采用Spearman相關性分析顯示，乳腺癌組織中JMJD3的表達與CD163的表達呈正相關(r=0.635，P=0.000)。

討 論

JMJD3在腫瘤中發揮抑癌或者致癌的雙重作用[4～6]。JMJD3在淋巴瘤、肝癌、腎癌、宮頸癌等惡性腫瘤中高表達，并通過促進腫瘤的增殖、轉移、抗凋亡及調控腫瘤微環境發揮促進腫瘤發展的作用；在結腸癌、肺癌及神經膠質瘤中表達水平較低，能夠促進干細胞的分化和細胞凋亡，發揮抑制腫瘤發展的作用。在膠質瘤的研究中發現，JMJD3可增加SNAI1的表達，促進膠質瘤的遷移和侵襲[7]。JMJD3在肺癌中表達顯著上升，并且在Ras激活的肺癌細胞中促進TGF介導的Smad激活和EMT[8]。IFN/STAT1/JMJD3軸可誘導ZEB1的表達，并增強肺癌的侵襲能力[9]。利用JMJD3的抑制劑GSK-J1作用于頭頸部鱗狀細胞癌細胞，可使細胞增殖受抑制，并誘導細胞凋亡[10]。JMJD3在彌漫大B細胞淋巴瘤的組織和細胞系中表達升高，并可激活NF-κB通路、上調BCL2表達而抗凋亡[11]。抑制JMJD3可減少腫瘤細胞的增殖并促進細胞凋亡，抑制腫瘤干細胞的分化[12]。本研究發現，JMJD3在乳腺癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，其表達與乳腺癌的TNM分期、ER、PR及淋巴結轉移有關：TNM分期越高，JMJD3的表達越高；ER和PR表達陰性的患者，JMJD3的表達更高；有淋巴結轉移的患者乳腺癌組織中JMJD3的表達明顯升高，這些結果提示JMJD3的表達可能與乳腺癌的進展和不良預后相關。

乳腺癌的不良預后與TAMs的浸潤密切相關。在一項納入4541例乳腺癌患者的Meta分析中發現，TAMs高密度浸潤與乳腺癌患者低生存率有關[13]。

使用納米顆粒雙重抑制集落刺激因子1受體(CSF1R)和MAPK途徑可誘導TAMs向M1型極化，抑制乳腺腫瘤的生長[14]；載有CSF1R和SHP2(src homology region 2 domain phosphatases-2)抑制劑的納米顆粒靶向M2型巨噬細胞，可將M2巨噬細胞復極化為M1表型，表現更強的細胞毒活性和吞噬作用，在乳腺癌小鼠模型中顯示出更強的抗腫瘤功效[15]。Chen等[16]利用質譜分析發現，M2型巨噬細胞分泌的CHI3L1在體內外均促進乳腺癌細胞的轉移。CD163是目前公認的M2型巨噬細胞表面標志物之一，本研究在乳腺癌中檢測CD163的表達結果發現，CD163在乳腺癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，其表達與TNM分期、PR陰性及淋巴結轉移有關，提示乳腺癌組織中有大量的M2巨噬細胞浸潤，并且其表達可能與乳腺癌的不良預后有關。采用Spearman相關性分析發現，乳腺癌組織中JMJD3的表達與CD163的表達呈顯著正相關，推測M2型巨噬細胞可能促進乳腺癌中JMJD3的表達，進而促進乳腺癌的發展和不良預后。

綜上所述，本研究發現，JMJD3在乳腺癌組織中表達上調，CD163在乳腺癌間質中表達明顯升高，兩者表達呈顯著的正相關，且兩者表達均與乳腺癌的TNM分期、PR陰性及淋巴結轉移有關。M2型巨噬細胞可能通過促進乳腺癌中JMJD3的表達，調控乳腺癌的發展，導致乳腺癌的不良預后，具體機制有待于后續開展更深入的研究。