森登-4湯治療骨性關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)篩選及驗(yàn)證

金剛 徐艷華 郝俊生 金英 烏云達(dá)來 趙巴根那 白紅柱 吉白格力瑪 額希寶力道

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028007 2.蒙古國國立醫(yī)科大學(xué)國際蒙醫(yī)學(xué)院，蒙古國 烏蘭巴托 15160 3.內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市市場(chǎng)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000 4.內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市翁牛特旗中蒙醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024500 5.內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市翁牛特旗旗醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024500

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)的患病率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1-2]，影響患者身心健康及生活質(zhì)量，其預(yù)防和治療更加受到重視。治療具有多樣性，蒙醫(yī)藥學(xué)診療理念以整體觀理論為指導(dǎo)，多元化、多成分、多靶點(diǎn)為獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。OA蒙醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病屬于“關(guān)節(jié)協(xié)日烏蘇病”范疇，視發(fā)病原因與體內(nèi)三根七素之相對(duì)平衡狀態(tài)失調(diào)，希日衰減而巴達(dá)干、赫依增盛，胃火減弱，筋肉骨骼處于逐漸衰弱之狀態(tài)有關(guān)[3-4]。森登-4湯作為蒙藥經(jīng)典良方組方簡(jiǎn)潔合理，對(duì)關(guān)節(jié)炎、黃水病等癥的治療具有其獨(dú)特的藥效，被收載于中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新型的藥物研究模式，整合各種藥物和生物數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)分析和構(gòu)建藥物-基因靶點(diǎn)蛋白-疾病的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型，預(yù)測(cè)藥物作用靶點(diǎn)[7-8]，具有前沿性、系統(tǒng)性、整體性的特點(diǎn)[9]。結(jié)合以上中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及特點(diǎn)，復(fù)方蒙藥具有與中藥相似的特點(diǎn)，強(qiáng)調(diào)“藥有個(gè)性質(zhì)之特長(zhǎng)，方有合群之妙用”的組合應(yīng)用形式，重視“君、臣、佐、使”的組合效果，因此借鑒中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)手段應(yīng)用于復(fù)方蒙藥成分及疾病靶點(diǎn)對(duì)接研究中，在此網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是中藥及蒙藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)嫁接的重要橋梁[10-11]。它適合復(fù)方蒙藥多成分、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)，本文首先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選并闡明森登-4湯對(duì)OA的作用靶點(diǎn)，為傳統(tǒng)蒙藥尋找新的作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)，進(jìn)一步采用免疫印跡法對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的篩選方法進(jìn)行考察，也為探討森登-4對(duì)OA的作用機(jī)制提供新的研究思路與方向，填補(bǔ)蒙藥結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的空缺。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

6月齡日本大耳白家兔，購自遼寧長(zhǎng)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。合格證號(hào)：SCXK(遼)-2015-0001。

1.2 試劑及儀器

主要試劑：森登-4湯(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室，中國)；Matrix metalloproteinases 13、tissue inhibitors of metalloproteinase 9抗體(abcam公司，美國)。主要儀器：DM2500光學(xué)顯微鏡(Leica公司，德國)；FUSION FX凝膠成像系統(tǒng)(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司，中國)；DYCZ-24DN蛋白質(zhì)電泳儀(北京六一儀器廠，中國)。

1.3 數(shù)據(jù)庫及軟件平臺(tái)

TCMSP數(shù)據(jù)庫、DISgeNET、PharmGkb、OMIM數(shù)據(jù)庫、NCBI等數(shù)據(jù)庫、OmicShare云平臺(tái)、Cytoscape3.7.2軟件。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選森登-4治療OA的潛在靶點(diǎn)

1.4.1森登-4中單味藥相應(yīng)化合物成分及靶點(diǎn)篩選[12]：本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)獲得梔子、訶子、川楝子、文冠木化合物信息，并以ADME條件為OB≥30%，DL≥0.18為條件篩選化合物，利用PubChem數(shù)據(jù)庫，保存化合物標(biāo)準(zhǔn)的Canonical SMILES格式。將SMILES格式文件導(dǎo)入Swiss target predictionn平臺(tái)，即為森等-4湯主要成分的靶點(diǎn)，得到藥物-成分-靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)。

1.4.2OA疾病相關(guān)靶點(diǎn)的檢索及獲取[13-14]：通過DISgeNET、PharmGkb、OMIM數(shù)據(jù)庫、NCBI等數(shù)據(jù)庫，以“Osteoarthritis”為關(guān)鍵詞，獲得與OA疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因，并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行合并，除去重復(fù)，最終獲得OA總靶點(diǎn)基因。

1.4.3森登-4治療OA的潛在靶點(diǎn)篩選：將“1.4.1”化合物靶點(diǎn)與“1.4.2”O(jiān)A相關(guān)靶點(diǎn)輸入OmicShare云平臺(tái)，進(jìn)行映射匹配，取重復(fù)靶點(diǎn)，篩選出森登-4湯與OA的共標(biāo)靶點(diǎn)，此為最終獲取的森登-4湯治療OA潛在靶點(diǎn)。

1.4.4“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：通過Merge工具將森登-4湯活性成分、潛在靶點(diǎn)、代謝通路數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 運(yùn)用動(dòng)物模型驗(yàn)證森登-4治療OA的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白

1.5.1動(dòng)物模型制備及給藥干預(yù)：采用改良Hulth法建立家兔OA模型[15]。將建立模型家兔分為模型組、實(shí)驗(yàn)組，每組8只，另有假手術(shù)組8只。實(shí)驗(yàn)組灌胃給予森登-4湯水煎液每日0.43 g/kg，假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水，持續(xù)用藥治療4周。取關(guān)節(jié)軟骨組織檢測(cè)相關(guān)蛋白。

1.5.2Westernblot法檢測(cè)家兔患側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)[16]：取家兔患側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織，提取總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，相應(yīng)一抗孵育，二抗孵育，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，對(duì)各樣品蛋白質(zhì)表達(dá)的灰度條帶采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)分統(tǒng)計(jì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 森登-4中單味藥相應(yīng)化合物成分及靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)獲得森登-4中單味藥梔子、訶子、川楝子、文冠木相應(yīng)的化合物信息，并以ADME條件為OB≥30%，DL≥0.18為條件篩選化合物得到37個(gè)，再利用PubChem數(shù)據(jù)庫保存化合物標(biāo)準(zhǔn)的Canonical SMILES格式。

2.2 森登-4湯治療OA潛在靶點(diǎn)

基于Swiss target predictionn平臺(tái)剔除重復(fù)項(xiàng)后得到739個(gè)基因靶點(diǎn)。通過DISgeNET疾病數(shù)據(jù)庫中骨性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，最終篩選出30個(gè)潛在靶點(diǎn)，見圖1和表1。

圖1 森登-4治療骨性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)韋恩圖A：森登-4相關(guān)靶點(diǎn)；B：骨性關(guān)節(jié)炎，膝關(guān)節(jié)；C：骨性關(guān)節(jié)炎，髖關(guān)節(jié)；D：骨性關(guān)節(jié)炎，肘關(guān)節(jié)Fig.1 Venn diagram of Sundon-4 targets in the treatment of osteoarthritisA: Sundon-4 correlation target; B:Osteoarthritis, Knee; C: Osteoarthritis, hip joint; D: Osteoarthritis, elbow joint

表1 森登-4治療骨性關(guān)節(jié)炎作用靶點(diǎn)Table 1 Therapeutic targets of Sundon-4 in the treatment of osteoarthritis

2.3 森登-4湯治療OA“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將活性成分、作用靶點(diǎn)、KEGG通路信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。篩選核心成分和靶點(diǎn)，結(jié)果顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)、環(huán)加氧酶2(PTGS2)、雌激素受體1(ESR1)、雌激素受體2(ESR2)、雄激素受體抗體(androgen receptor，AR)、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A(VEGFA)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、核因子KB1(NFKB1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、過氧化物酶體增殖因子活化受體A(PPARA)等靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，從而可以看出森登-4湯多成分-多靶點(diǎn)-多通路的作用特點(diǎn)。見圖2。

圖2 “森登-4單味藥-活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.2 “single drug -active ingredient-target -pathway” network注：圓形節(jié)點(diǎn)代表單味藥，六邊節(jié)點(diǎn)代表活性成分，四邊節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)，長(zhǎng)方形節(jié)點(diǎn)代表作用通路

2.4 Western blot法檢測(cè)家兔軟骨組織MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)變化

與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 家兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)比較A：假手術(shù)組；B：模型組；C：實(shí)驗(yàn)組Fig.3 Comparison of protein expression between MMP-9 and MMP-13 in the knee joint cartilage of rabbitsA: Sham-operated group; B: Model groups; C: Experimental group

3 討論

蒙藥及其復(fù)方具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的獨(dú)特之處，起到影響多條通路及靶點(diǎn)的作用[17]，本研究在前期研究者提出“多組分、多目標(biāo)”是蒙醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的特點(diǎn)[18]，通過本研究闡明森登-4湯核心成分靶點(diǎn)為MMP13、MMP9、MMP1、MMP2、PTGS2、ESR1、ESR2、AR、TNF、VEGFA、NFKB1、IL-6、PPARA等，在此結(jié)論下采用更接近人類關(guān)節(jié)炎的模型，運(yùn)用Western blot法對(duì)其中的MMP13、MMP9蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，得到相關(guān)結(jié)論，森登-4湯明顯下調(diào)OA疾病過程中關(guān)節(jié)軟骨組織MMP13、MMP9蛋白。這就驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選與WB法等分子生物學(xué)有高度一致性，同時(shí)闡明了森登-4對(duì)OA的作用靶點(diǎn)。本方法為下一步的驗(yàn)證工作成為方法學(xué)提供參考，課題組將進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)蛋白通路的驗(yàn)證，為其進(jìn)一步的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)分析和作用機(jī)制研究提供依據(jù)。