金匱腎氣丸防治骨質疏松癥的機制研究

李偉杰 梁潤英

河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)以骨量降低、骨組織微結構損壞，致骨脆性增加，易發生骨折為特征的常見全身性骨骼疾病，典型臨床表現為疼痛、脆性骨折、脊柱變形等[1]；并且OP與年齡及性別關系密切[2]。當前OP的主要治療藥物有骨吸收抑制劑、骨形成促成劑和其他機制類藥物，如長期使用則會有一定不良反應；某些臨床基礎病的OP患者，使用這些藥物時也有一定限制[3]。中醫藥防治OP逐漸被普通民眾和患者認可，引起國內外學者廣泛關注[4-5]。據OP臨床表現將其歸于中醫“骨痿”“骨痹”“骨枯”范疇，主要病機為腎精虧虛，髓海空虛，骨失濡養[6]。

金匱腎氣丸(Jinkui Shenqi Pills，JSP)出自漢·張仲景《金匱要略》，由熟干地黃、山藥、山茱萸、桂枝、附子、澤瀉、茯苓、牡丹皮組成，可補腎固本，填精益髓，腎之精氣旺，則骨髓得充、筋肉得養。但目前對該方防治OP作用機制的研究較少，故本研究以探索“藥物-疾病”之間的關系為本，從宏觀至微觀層面挖掘JSP防治OP的主要成分、關鍵靶標基因和信號通路等，系統探討其作用機制，揭示中醫藥復方“多成分-多途徑-多靶點”的作用機理，為JSP防治OP的機制研究與實驗驗證提供參考依據，也為治療OP提供理論支撐，從而推動經方的現代化研究進程。

1 資料與方法

1.1 JSP活性成分及潛在作用靶標收集

從中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，http//tcmspw.com/tcmsp.php)檢索JSP中熟地、山藥、山茱萸、桂枝、附子、澤瀉、茯苓、牡丹皮的活性成分；以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18篩選活性成分。將篩選得到的各中藥活性成分所對應的靶標蛋白名輸入STRING(https://string-db.org)數據庫，映射出標準基因名。建立JSP“藥物-活性成分-靶標基因(Herb-Ingredient-Target，H-I-T)”數據集，用Cytoscape3.6構建“H-I-T”網絡圖，用Network Analyzer插件進行網絡拓撲學分析，以Degree≥50為標準評價藥效和靶標重要性，獲取和分析關鍵活性成分。

1.2 OP疾病基因、與JSP藥靶交集基因信息收集

以“Osteoporosis”為關鍵詞在DisGeNET(http://www.disgenet.org/)和GeneCards(https://www. genecards.org/)中查詢疾病基因后去重、整合，建立疾病基因數據集。取JSP活性成分靶標和OP疾病基因交集，制作韋恩圖，探究JSP活性成分對OP靶標的靶向作用。

1.3 JSP-OP交集靶標PPI網絡構建與關鍵基因篩選

將JSP-OP共同靶標基因輸入STRING，設置“Homo sapiens”為物種，“high confidence(0.700)”為最低相互作用閾值，隱藏網絡中無關聯節點，得到蛋白質相互作用(PPI)網絡文本信息后輸入Cytoscape3.6，獲取可視化PPI網絡圖；關鍵基因在相關通路中會影響其他基因調控，用CytoHubba 插件[7]對PPI網絡進行拓撲結構分析，MCC值越高節點在網絡中越重要；Degree值越大越可靠，故以二者為參考，識別和篩選關鍵基因。

1.4 關鍵基因GO、KEGG通路富集分析

將關鍵基因輸入David(https：//david.ncifcrf.gov/)數據庫，富集分析GO生物功能與KEGG通路，以P≤0.05表示結果顯著性，P值越小越顯著。按P值由小到大排序，將GO生物功能中富集度高的前10名生物途徑(BP)、分子功能(MF)和細胞組分(CC)及前30名 KEGG通過Omicshare工具( http://www.omicshare．com/tools/)用高級氣泡圖形式展現，再通過京都基因與基因組百科全書(https://www.kegg.jp/)描述通路，找出重要通路并標記關鍵基因。

2 結果

2.1 JSP“藥物-活性成分-靶標基因”數據收集結果與H-I-T網絡圖

2.1.1金匱腎氣丸“藥物-活性成分-靶標基因”數據：篩選后刪除重復項并剔除未匹配到靶標者，符合OB≥30%、DL≥0.18并可進一步研究的活性成分有47個，詳見圖1和表1。經STRIN映射刪除重復項及非人體作用后的活性成分蛋白靶標，得到藥靶基因196個。

圖1 活性成分及對應靶標基因數據Fig.1 Data of active ingredients and corresponding target genes

表1 47種重要活性成分及對應靶標數Table 1 Data of 47 active ingredients and corresponding targets

2.1.2金匱腎氣丸“H-I-T”網絡圖：圖2為“H-I-T”網絡圖，該網絡有251個節點和1 212條邊，圖中黃色菱形節點為JSP中藥物，紅色“V”形節點為藥物活性成分，綠色圓形節點為藥物活性成分的靶標基因。經網絡拓撲學分析，Degree≥50的活性成分有：槲皮素(Quercetin，145)、豆甾淳(Stigmasterol，81)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol，62)、山柰酚(Kaempferol，57)，可能為JSP防治OP的主要活性成分。圖3為“H-I-T”部分聚集網絡，更清晰地展示了中藥、活性成分、靶標基因間通過“邊”相連，它們之間相互作用，體現了JSP發揮治療作用時“多成分-多靶點”的特點。

圖2 中藥-活性成分-靶標網絡(H-I-T network)Fig.2 Herb-ingredient-target network

圖3 中藥-活性成分-靶標部分聚集網絡Fig.3 Herb-ingredient-target partial aggregation network

2.2 OP疾病基因及與JSP藥靶基因的交集基因信息

將在DisGeNET和GeneCards 檢索到的OP疾病基因去重后歸一整合，得到4 416個疾病基因。取疾病基因與196個JSP藥靶基因的交集，獲得145個JSP防治OP的潛在可能靶標基因，Venn圖見圖4。

圖4 JSP-OP藥物靶標基因與疾病基因Venn圖Fig.4 Venn diagram of JSP-OP

2.3 關鍵基因篩選結果及JSP-OP交集和關鍵靶標基因PPI網絡

取MCC值前50的基因，按Degree值由大到小排序，排名前30的基因即為關鍵基因，詳見表2。構建JSP-OP交集和關鍵靶標基因PPI網絡圖，見圖5。隱藏無關聯節點后有8個基因未參與網絡構建，故該網絡有137個節點，1 116條邊。圖5中八邊形節點為107個非關鍵基因，菱形節點為30個關鍵基因，節點越大說明其MCC和Degree值越高，在網絡中作用越顯著。圖與表結合，推測AKT1、TP53、IL6、MAPK1、MAPK8、JUN可能為JSP防治OP的核心靶標。

表2 30個關鍵基因信息數據Table 2 Information of 30 key genes

圖5 JSP-OP交集和關鍵靶標基因PPI網絡圖Fig.5 PPI network of JSP-OP target genes

2.4 關鍵基因 GO生物功能和KEGG通路富集分析結果

2.4.1GO生物功能富集分析結果：結合GO富集結果及氣泡圖，可得JSP-OP關鍵基因主要參與的生物途徑有藥物反應、轉錄正調控和DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控；分子功能主要有酶、相同蛋白以及蛋白等的結合；關鍵基因主要調控核漿、胞漿、細胞核等細胞組分，詳見圖6。

圖6 GO生物功能富集分析Fig.6 GO biological enrichment analysis

2.4.2KEGG通路富集分析結果：通路富集后共得到85條相關信號通路，篩選后排名前30的通路詳細信息氣泡圖見圖7。根據氣泡大小及表現，忽略與“cancer”及其他明確疾病直接相關的通路，JSP-OP交集和關鍵基因所涉及的重要通路有：TNF、MAPK、PI3K-Akt等，通路詳圖見圖8～10。以紅色和綠色分別標記JSP-OP交集關鍵基因與非關鍵基因可能作用的潛在靶標。

圖7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathways of the intersecting target genes

圖8 TNF 信號通路Fig.8 TNF signaling pathway

3 討論

《素問·六節藏象論》言“腎者……其充在骨”，《靈樞·經脈篇》又言：“足少陰氣絕，則骨枯”，而OP的中醫病因病機總以腎之虛損為主，故當補腎固本、填精益髓；臨床實踐表明，金匱腎氣丸可使腎之精氣旺，骨髓得充、筋肉得養，對OP有很好的防治效果。槲皮素和山萘酚主要來自JSP中的牡丹皮，牡丹皮有活血散瘀之功，又能通利經脈，可促使腎中精氣的蒸騰氣化；研究表明槲皮素能促進成骨細胞分化活性，抑制破骨細胞骨吸收、誘導破骨細胞凋亡，促進骨髓間充質干細胞的增殖和骨向分化，并通過上調BMP2和Smad4 的表達改善骨質疏松癥[8-9]；高劑量山萘酚可調節體內Ca2+的代謝平衡，促進骨膠原生成并減少骨小梁丟失，故對OP有治療作用[10]。β-谷甾醇和豆甾醇均屬植物甾醇類，主要存在熟地黃、山藥、山茱萸、桂枝中，JSP方以熟地為君，“填骨髓，長肌肉”，滋陰血補腎精；山藥健脾固腎，助地黃生腎精之功，山茱萸補益肝腎，兩藥合用，滋養腎精，亦可促使腎精發揮正常生理作用；桂枝溫通經脈，輔地黃、山茱萸、山藥以陽中求陰，使腎中精氣充盛，機體氣化歸于正常；β-谷甾醇能促進成骨作用、有效抑制破骨作用達到護骨的目的，且能作用于卵巢顆粒細胞(骨細胞外的另一靶部位)，促使其產生分別與成骨及破骨細胞膜上雌激素受體結合的E2，協同調節骨代謝平衡[11]。

圖9 MAPK 信號通路Fig.9 MAPK signaling pathway

圖10 PI3K-Akt 信號通路Fig.10 PI3K-Akt signaling pathway

NCOA2表達在多種激素反應組織上，參與生殖發育、骨形態發生、癌癥及其他病理情況[12]。PTGS2又稱COX-2，與細胞炎癥反應密切相關，中性粒細胞調節炎癥的機制之一是COX-2的分泌，下調COX-2能減輕炎癥反應[13]。骨形成與骨破壞失衡是OP發病的重要原因，JSP中槲皮素、豆甾淳、β-谷甾醇、山柰酚等重要活性成分通過整體調控激素水平、抗氧化、免疫調節等抑制骨吸收和促進骨生成方面，促進成骨細胞與破骨細胞平衡；炎癥和破骨細胞的相互作用導致OP[14]，以上重要活性成分均有抗炎作用，而PTGS2也可能是JSP防治OP的重要一環。綜上，JSP中槲皮素、豆甾淳、β-谷甾醇、山柰酚等主要藥物活性及其對應的較為顯著的靶標基因NCOA2、PTGS2之間相互影響、相互作用，可能為防治OP的關鍵。

PPI網絡分析和關鍵基因篩選結果表明，JSP作用于OP的關鍵靶標基因為AKT1、TP53、IL6、MAPK1、MAPK8、JUN。AKT家族基因與骨骼肌肉的發育密切相關，可調控細胞生存、增殖、代謝、凋亡[15]，敲除大鼠AKT1與AKT2基因，其骨骼、肌肉表現為發育不全[16-17]，考慮破骨細胞活性大于成骨細胞。目前未見TP53與OP發生機制的研究，但可明確：藥物干預能激活相應靶標基因，引導成骨細胞增殖分化及破骨細胞凋亡，提示JSP中相關活性成分通過TP53誘導成骨或破骨細胞生物學過程對OP產生影響。IL6是調節骨吸收的促炎細胞因子，其水平增加可刺激破骨細胞形成并誘導其活性增強，致骨代謝失衡性骨質疏松，拮抗或敲除IL6可阻止骨小梁中破骨細胞增加[18-19]。MAPK1和MAPK8均屬MAPK激酶家族，參與細胞生長及分化調節，能誘導血管內皮細胞形成、促進成骨細胞增殖與分化，調節骨形成[20]；JUN為快速反應基因，與靶基因上調節區AP-1位點結合促進成骨細胞增殖與分化，并在其相關基因表達中發揮重要作用[21]。OP與成骨細胞產生率和破骨細胞凋亡率密不可分，調控關鍵靶標基因可使二者處于平衡狀態，即通過調節骨代謝防治OP[22]。

GO富集分析結果表明JSP發揮效應的細胞場所與其生物功能過程相一致：在胞外及蛋白質復合物上進行蛋白質結合代謝、調控及酶結合，進而參與到包括氧化、藥物、氨基酸等應激反應在內的復雜生物過程；在細胞核區參與轉錄因子、DNA及RNA特異性結合，調控細胞生長、增殖、凋亡等細胞周期過程。上述JSP-OP關鍵基因調控成骨與破骨細胞所涉及的細胞增殖分化、信號轉導及受體結合等文獻報道，與本研究GO富集結果一致。

通路富集結果顯示，TNF、MAPK、PI3K-Akt等信號通路富集大量關鍵基因；HIF-1、Toll樣受體、雌激素、破骨細胞分化等信號通路富集較多關鍵基因；以上通路可能為JSP防治OP的關鍵通路。TNF信號通路主要傳導炎性因子，炎性因子TNF-α參與絕經后OP的發生，抑制成骨細胞并促進破骨細胞分化，還可促進RANKL的表達，誘導破骨細胞形成[23-24]。MAPK信號通路通過調控細胞增殖分化發揮相應生物功能，在骨代謝平衡方面作用重要[25]。PI3K-Akt信號通路在細胞生物過程和骨代謝方面都很重要，PI3K-Akt途徑的激活能刺激成骨細胞增殖和分化，并抑制其凋亡；還可影響破骨細胞形成及分化[26]；而PI3K-Akt與 MAPK信號通路可協同調控成骨及破骨細胞，影響二者增殖、分化與凋亡[27]。上調HIF-1信號通路可通過血管-成骨偶聯促進骨和血管形成，增加破骨細胞的活性及數量，影響骨形成與吸收[28-29]。Toll樣受體信號通路與MAPK及Akt通路協同作用，降低受體磷酸化水平及破骨細胞的骨吸收[30]；骨細胞上的Toll樣受體4參與由TLR通路介導的下游NF-KB表達活化破骨細胞[31]。雌激素參與成骨與破骨細胞生物過程，維持二者動態平衡，并影響間充質干細胞向成骨方向增殖、分化[32]；還可通過免疫細胞分泌的成骨細胞與細胞因子間接抑制破骨細胞分化、增殖，降低其活性[33]，故該通路在調節骨代謝平衡方面作用重大。破骨細胞分化通路直接與OP相關，TNF、IL-1、雌激素等作用于該通路，影響破骨細胞生長和凋亡；且破骨細胞受體內、外因素和復雜信號通路共同調節；一旦平衡被打破，可致OP、股骨頭壞死、骨硬化病等多種骨代謝疾病[34-35]。

不同疾病之間相互關聯與影響，具有微妙的調控機制：類風濕性關節炎可使關節面軟骨及軟骨下骨因炎癥因子及增生的滑膜組織而破壞，致破骨細胞活性增強、骨吸收進程加快[36-37]；非酒精性脂肪肝影響諸多代謝通路來調節骨密度[38]；2型糖尿病患者體內異常活化的炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6等打破骨形成與吸收之間的代謝平衡，誘發OP[39]；據此可推測，JSP能通過類風濕性關節炎、非酒精性脂肪肝、糖尿病等疾病相關通路防治OP。

4 總結與思考

本研究依據數據庫信息，發現金匱腎氣丸中的槲皮素、豆甾淳、β-谷甾醇、山柰酚等核心活性成分通過TNF、MAPK、PI3K-Akt、HIF-1等信號通路干預AKT1、TP53、IL6、MAPK1、MAPK8、JUN等關鍵靶標表達，促進成骨細胞生成、抑制破骨細胞分化，維持骨代謝平衡，從而防治骨質疏松癥。在理論層面為金匱腎氣丸活性成分篩選、防治骨質疏松相關靶標及通路預測提供數據支撐，有助于揭示金匱腎氣丸防治骨質疏松癥的科學內涵。但并未將金匱腎氣丸與骨質疏松癥的相關證型做對應；臨床應用上，金匱腎氣丸各中藥活性成分及其含量在炮制過程中可能會相互作用甚至發生變化。故擬開展動物實驗、分子生物學、藥理藥效代謝學等更深入的探索性研究，驗證并對應本研究結果，積極探索中醫藥與骨質疏松癥防治的結合點。為更好地傳承與發揚仲景學術思想及經方研究奠定基礎，推動中醫藥現代化發展進程。