不同前處理條件及檢測波長下紫外分光光度法檢測麻味物質的差異

王朝輝，彭 敏，鄭維興，楊延康，劉應琪，靳澤榮*

（1.四川敏恩檢測技術有限公司，四川成都 610000；2.成都圣恩生物科技股份有限公司，四川成都 610000）

花 椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）是 蕓 香科、花椒屬植物，因其獨特的“麻味”口感而被譽為“八大味”之一；其原產于中國西南地區（四川、云南、貴州和甘肅等地），人們通常所說的花椒也專指果皮部分，本文所提花椒也指這一部分[1-2]。

花椒的麻味主要由酰胺類物質產生，主要成分為鏈狀不飽和脂肪酰胺（包括山椒素、花椒素等），具有強烈的刺激性[3-5]。目前花椒麻味物質的檢測方法主要有液相色譜法、氣相色譜法和紫外分光光度法[6-7]。王洪偉等[8-12]對以上3種檢測方法進行對比，結果表明紫外分光光度法檢出限高于兩種方法，但在回收率、精密度等方面無明顯差異，并且紫外分光光度法具有操作簡單、檢測速度快、成本低、適合大量樣品檢測等優點，因此大多企業實驗室均采用紫外分光光度法進行檢測。同時，由于產生麻味的酰胺類物質有較強的揮發性，不易提純及保存，故一般通過檢測其吸光度值，結合系數折算計算含量[13-19]。2020年9月1日實施了《花椒及花椒加工產品 花椒酰胺總含量的測定 紫外分光光度法》（GH/T 1290—2020），在此之前實驗室使用的為參考各文獻制定的行業內部的檢測方法，兩種方法流程及計算間有一定的差異。本文對花椒麻味物質檢測前處理方式、兩種不同的紫外分光光度法檢測麻味物質的方法進行實驗對比，研究其差異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒顆粒、花椒粉，四川翠宏食品有限公司；花椒精油，晨光生物科技集團股份有限公司；甲醇，成都市科龍化工試劑廠；針頭式過濾器（0.22 μm），天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800紫外可見分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司；ME204電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；600Y多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；SB25-12DTDN超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 樣品前處理

1.3.1 方法一（行業內部檢測方法）

（1）花椒顆粒/花椒粉樣品處理。將花椒顆粒用粉碎機適當粉碎，過20～30目篩，準確稱取0.5～1.0 g花椒粉末（可依據麻度大小適量稱取）于150 mL具塞三角瓶中，加入約50 mL甲醇溶液，置于水溫40 ℃超聲波清洗機中提取30 min，用中性濾紙將提取液過濾，收集濾液于100 mL容量瓶中并定容至刻度。

（2）花椒精油類樣品處理。準確稱取0.1 g左右的液體產品于100 mL三角瓶中（依據推測麻度大小適量稱?。?，加入約50 mL甲醇溶液，放入攪拌子，蓋上三角瓶塞，穩定攪拌約30 s，將提取液轉移至100 mL容量瓶，收集甲醇提取液并定容至100 mL。

1.3.2 方法二（行業標準方法）

（1）花椒顆粒/花椒粉樣品處理。將花椒顆粒用粉碎機粉碎后過20目篩，混勻；稱取1 g（精確至0.000 1 g）樣品于燒瓶中，加甲醇50 mL，超聲萃取0.5 h，待提取液冷卻至室溫，轉移至100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，移取上清液10 mL于50 mL容量瓶定容，經0.22 μm濾膜過濾，待測。

（2）花椒精油樣品處理。稱取0.2 g（精確至0.000 1 g）液體樣品于具塞燒瓶中，加甲醇50 mL，超聲萃取0.5 h，待提取液冷卻至室溫，轉移至100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，經0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.4 測定方法

1.4.1 方法一測定方法

準確移取中間濾液1 mL于另一100 mL的容量瓶中，定容至刻度，搖勻，以甲醇作空白對照，測量樣品在254 nm波長下的吸光度值（吸光度值在0.2～0.8最佳），將吸光度值帶入折算公式計算得出麻味物質含量。

1.4.2 方法二測定方法

以甲醇為參比，測定樣品液在270 nm處的吸光度，吸光度超出儀器測定范圍的樣品液用甲醇稀釋后測定。將吸光度值、稀釋倍數帶入折算公式計算得出試樣中麻味物質總量。

1.5 結果計算

樣品中花椒麻味物質含量的計算公式為

式中：X為樣品中花椒麻味物質含量，mg·g-1；A為樣品溶液吸光度；V為樣品定容體積，mL；m為樣品質量，g；E為吸光系數。

2 結果與分析

2.1 過0.22 μm有機濾膜對檢測結果的影響

選取不同批次的青花椒顆粒、花椒顆粒、花椒粉和花椒精油進行處理后不過0.22 μm有機濾膜，檢測樣品的吸光度值；再將樣品過0.22 μm有機濾膜，檢測樣品的吸光度值；分別計算其麻味物質含量，再將各組數據分別進行獨立雙樣本T檢驗，對比過濾膜和不過濾膜對檢測結果的影響[20]。分析數據見表1和表2。

表1 不同基質使用兩種方法進行過濾膜/不過濾膜對比檢測結果

表2 不同基質使用兩種方法進行過濾膜/不過濾膜對比T檢驗分析結果

方法一和方法二測試溶液是否過0.22 μm有機濾膜上機檢測的結果差異很小，P值為0.770～0.996，均大于0.05，統計結果均為不顯著，表明過濾膜的步驟對麻味物質的檢測結果無顯著影響。

2.2 過篩對檢測的影響

對于花椒顆粒樣品，方法一和方法二均為碎樣后過篩檢測，但觀察發現花椒顆粒的皮更易粉碎，內殼相對較難粉碎，而麻味物質主要存在于花椒果實的皮中，因此花椒顆粒樣品過篩后檢測的結果是否能代表整顆花椒的麻味物質含量需進行實驗驗證。實驗選取10批次的青花椒顆粒和紅花椒顆粒分別使用方法一和方法二進行不過篩和過篩處理后檢測，計算結果見表3。同時對4組數據進行獨立雙樣本T檢驗，計算結果見表4。

由表3和表4可知，方法一和方法二過篩后的麻味物質檢測值和過篩前的檢測值無明顯增加或下降的變化規律，P值均大于0.05，表明數據間不存在顯著性差異，在不同批次的花椒顆粒的檢測中，過篩對檢測結果無顯著的影響。

表3 花椒顆粒使用不同檢測方法進行過篩/不過篩對比檢測結果

表4 花椒顆粒使用不同檢測方法進行過篩/不過篩對比T檢驗分析結果

2.3 不同方法檢測結果的差異性

分別對不同批次的青花椒顆粒、紅花椒顆粒、花椒粉和花椒精油進行兩種方法的處理并檢測，以方法一檢測值減去方法二檢測值表示相對行業標準方法行業內部檢測方法檢測值的增加值，再除以行業標準檢測值表示其増比值，計算結果見表5。對各組數據進行獨立雙樣本T檢驗分析，分析兩種方法間的差異性，計算結果見表6。

表5 不同基質使用兩種方法檢測對比結果

（續表5）

表6 不同基質使用兩種方法檢測對比T檢驗分析結果

方法一所測得的麻味物質含量均高于方法二的測試結果，麻味物質含量增加值較為一致，増比受樣本本身麻味物質含量大小影響，由于花椒精油自身麻味物質含量較高，増比相對其他3種基質更低。使用雙樣本獨立T檢驗分析結果為青花椒顆粒、紅花椒顆粒、花椒粉3種基質的P值分別為0.000、0.018、0.000，均小于0.05，表明這3種基質下兩種方法檢測結果存在顯著性差異，花椒精油基質的P值為0.259，大于0.05，表明此基質下兩種方法的檢測結果不存在顯著性差異。

2.4 兩種方法檢測結果的相關性

以方法二檢測結果為因變量Y、方法一檢測結果為自變量X，對每組數據進行線性回歸計算以驗證檢測結果的相關性，結果見表7。計算得出相關系數均在0.9以上，線性相關系數較好，總樣本的相關系數為0.999 1，線性良好。以方法一檢測結果通過總樣本的線性回歸方程計算方法二的檢測結果預測值，對方法二的實測值及預測值進行雙樣本配對T檢驗分析[21]，驗證預測值與實測值的差異，見表8。P值為0.994，大于0.05，表明回歸計算后的預測值和實測值無顯著性差異。

表7 不同基質及總樣本兩種方法檢測結果的線性回歸計算

表8 方法二實測值/回歸計算預測值雙樣本配對T檢驗

3 結論

本文對兩種基于紫外分光光度計對花椒麻味物質檢測方法的過濾膜、過篩處理過程對檢測結果的影響進行了驗證分析，同時對兩種方法之間的差異進行分析，并對青花椒顆粒、紅花椒顆粒、花椒粉和花椒精油4種常見基質分別進行了檢測分析。結果表明，過濾膜對兩種檢測方法、不同基質的檢測結果均無顯著影響；過篩對兩種方法的檢測結果也無顯著影響，但過篩后結果可能精密度更高，使檢測結果更穩定；兩種方法在精油基質下檢測結果無顯著性差異，在花椒顆粒、花椒粉基質下存在顯著差異；方法間的差異具有一定相關性；以總樣本分析，兩種檢測方法的檢測結果相關性良好，因此可以認為兩種方法對麻味物質的檢測均可行，但兩者之間還存在一定的差異，在實驗室檢測分析及不同樣品對比時最好選取其中一種檢測方法持續使用。本研究可為麻味物質檢測方法的簡單化、一致性以及可對比性研究提供一個新的的思路。