微萃取-高效液相色譜法測定谷物中的維生素E

張小寧，劉 偉，崔利輝

（楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西咸陽 712100）

維生素E（Vitamin E）是一種脂溶性維生素[1]，其水解產(chǎn)物是以α為主要活性的多種生育酚[2]，也是最主要的抗氧化劑之一[3]。維生素E多溶于乙醇，幾乎不溶于水，對堿不穩(wěn)定，但對熱、酸穩(wěn)定[4]。經(jīng)高溫處理后的維生素E活性明顯降低。生育酚能促進性激素分泌，使男子精子活力和數(shù)量增加；使女子雌性激素濃度增高，提高生育能力，預(yù)防流產(chǎn)；還可用于防治男性不育癥、燒傷、凍傷、毛細血管出血、更年期綜合征以及美容等方面[5]。維生素E的檢測技術(shù)繁多，樣品前處理技術(shù)[6]包括固相萃取、液液萃取、分散液相微萃取、固相支撐液液萃取和直接蛋白沉淀法；分離定量檢測技術(shù)[7]包括自動生化分析法、酶聯(lián)免疫吸附法、氣相色譜法、液相色譜法和超高效超臨界流體色譜法。GB 5009.82—2016采用了多皂化、萃取前處理技術(shù)和正反相高效液相色譜法測定維生素E。本研究依據(jù)皂化原理采用微萃取的方法進行反相液相色譜分析。

1 材料與方法

1.1 材料

大米、玉米（超市自購）。

1.2 試劑與對照品

甲醇（色譜級），美國天地；乙醇、氫氧化鉀、抗壞血酸和乙醚（AR），西隴；α、β、δ生育酚標(biāo)準(zhǔn)品（產(chǎn)品編號71031-10 mg、710065-10 mg、71031-10 mg），北京壇墨質(zhì)檢。

1.3 設(shè)備儀器

LC30A超高效液相色譜儀，Shimadzu；MD-200氮吹儀，上海滬析實業(yè)有限公司；SHZ-2水浴振蕩器，常州市神科儀器廠；Allegra 64R低溫高速離心機，Beckman；ME204電子天平，Mettler Toledo。

1.4 實驗方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取0.01 g（精確到0.000 1 g）α、β及δ生育酚標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至 100 mL，配制成濃度為 100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和5.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈稀釋并定容至 10 mL，配制成濃度為 2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1和 50.0 mg·L-1系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.2 樣品處理

稱取約0.100 g大米或玉米樣品于10 mL離心管中，加入1 mL水和20 mg淀粉酶，60 ℃水浴避光振蕩，取出后加入0.1 g抗壞血酸、1.5 mL乙醇、1.5 mL 50 %氫氧化鉀溶液，混勻后80 ℃水浴皂化30 min，冷卻至室溫，加入4 mL乙醚渦旋2 min，8 000 r·min-1離心5 min，取上層乙醚層氮吹干，甲醇定容至0.5 mL，溶液過0.22 μm尼龍濾膜，液相色譜測定。

1.4.3 色譜條件

色 譜 柱： 島 津 Shim-pack XR-ODS（2 mm×75 mm，1.6 μm）色譜柱；流速：0.5 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；流動相A：水；流動相B：甲醇+水（97+3）；等度洗脫；檢測波長：λex=294 nm，λem=328 nm；采集頻率：100 ms；外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

本文采用超高效液相色譜法-熒光檢測器測定維生素E含量，δ、β和α生育酚依次出峰，色譜圖如圖1所示。

圖1 維生素E混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 不同微萃取體積對3種生育酚萃取效率的影響

實驗考察了3 mL、4 mL和5 mL這3個萃取體積對3種生育酚的萃取效率。樣品經(jīng)氫氧化鈉溶液皂化后，分別向平行樣品中加入體積為3 mL、4 mL、5 mL的乙醚，渦旋2 min進行萃取，8 000 r·min-1離心5 min，對上層乙醚層氮吹近干，0.5 mL甲醇復(fù)溶后進行液相色譜分析，以3 mL萃取體積所得峰面積響應(yīng)為基準(zhǔn)，峰面積比值為參考依據(jù)，結(jié)果表明，4 mL萃取效率最高。

表1 不同萃取體積對3種生育酚的萃取效率

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及定量限

實驗先后測定濃度為 2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1和 50.0 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，得到線性回歸方程的R＞0.999。依據(jù)信噪比S/N=3計算各生育酚的檢出限，S/N=10計算各生育酚的定量限，結(jié)果如表2表示。

表2 維生素E標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和定量限

2.4 回收率及精密度實驗

稱取制備后的大米0.1 g，依次加入0.02 mL、0.10 mL和0.20 mL濃度均為50.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)液至稱量樣品中，得到濃度為 10.0 mg·kg-1、50.0 mg·kg-1、100.0 mg·kg-1的添加樣品，并做空白對照，按照1.4.2進行樣品處理并測定，所得結(jié)果如表3所示

表3 大米中的3種生育酚的回收率及精密度結(jié)果

2.5 樣品測定結(jié)果

實驗選擇大米和玉米樣品，分別測定6次，計算其中3種生育酚的含量。3種生育酚的當(dāng)量計算依據(jù)GB 5009.82—2016，維生素E總量測定結(jié)果以α-生育酚當(dāng)量（α-TE）表示，計算公式為維生素E=α-生育酚+β-生育酚×0.5+δ-生育酚×0.1。維生素E的測定含量和精密度見表4。

表4 維生素E的含量和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論

本研究基于微萃取的技術(shù)理念，采用超高效液相色譜法，建立了一種處理簡單、快速、準(zhǔn)確定量分析大米和玉米中維生素E的方法，實現(xiàn)了將GB 5009.82—2016中第一法預(yù)處理簡便化，減少了試劑用量，提高了檢測靈敏度，縮短了單次分析時間，提高了實驗室工作效率。結(jié)果顯示，本方法可以在10 min內(nèi)完成維生素E的測定，具有較小的精密度（＜ 10%）。各組分在 2.0～ 50.0 mg·L-1，峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系R大于0.999，定量限為0.05～0.12 mg·L-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.56%～7.80%。