QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測水產品中多種獸藥殘留

陳曉嘉，陳 茹，韋 譽，貝榮廷，周芳梅，馮志強

（1.廣東省食品質量監督檢驗站，廣東廣州 510000；2.廣東省食品工業研究所有限公司，廣東廣州 510000；3.江蘇廣海檢驗檢測有限公司，江蘇南通 226121）

獸藥殘留指動物產品的任何可食部分所含獸藥母體化合物或其代謝物，以及與獸藥相關的雜質殘留。近年來食品中獸藥殘留成為食品安全領域的熱點和焦點[1-7]。在我國，濫用、亂用限制使用的藥物、非法使用禁止使用的藥物的現象屢禁不止，喹諾酮類、磺胺類、硝基咪唑類等化合物在水產養殖方面使用較多，藥物濫用易造成水產品污染，通過食物鏈可在人體內蓄積并具有使人體產生抗藥性等副作用的可能性。因此，對抗生素的殘留進行監測對促進水產品食品安全具有極其重要的意義[8-15]。

我國發布了多項法規以規范獸藥規范使用，也明確水產品中獸殘及其代謝物的檢出限量范圍。目前有近百種獸藥在水產養殖行業中使用[16]，其性質各異，國家標準方法多以化學結構類似的同族化合物進行分析方法開發，對同一水產品樣本中的獸藥殘留目前沒有合適標準方法進行同步快速篩查[17]。在現有相關的多種獸藥殘留分析方法中，存在前處理步驟較多、分析時間較長、基質涵蓋較小等局限性。基于此，本研究建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法對魚、蝦等水產品中喹諾酮類、磺胺類、硝基咪唑類3大類46種獸藥的高通量檢測技術，提高了多殘留獸藥的檢測效率，可以滿足水產品中多種類獸藥風險篩查及監測工作的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水產品：魚、蝦，采購于市場。

試劑：甲醇（LC-MS，Honeywell）；乙酸銨（HPLC，阿拉丁）；乙腈（HPLC，CINC）；甲酸（LC-MS，ACS）；正己烷（HPLC，Honeywell）；冰乙酸（分析純，康科德）；C18（40～ 60 μm，60?，艾杰爾）；PSA（40～60 μm，60A，艾杰爾）；無水硫酸鈉（分析純，廣州化學試劑廠）；0.22 μm濾膜（艾杰爾）；超純水（Milli-Q）。

標準品：46種化合物（17種喹諾酮類、24種磺胺類、5種硝基咪唑類）的標準品生產于Tmstandard、Dr.Ehrenstorfer、Bepure、CATO、First Standard、ANPEL，純度為86.5%～100%。

1.2 儀器與設備

AB Sciex Triple Quad 5500 超高效液相色譜質譜聯用儀（AB公司）：配有電噴霧（ESI）離子源；超聲儀（新芝生物科技）；渦旋振蕩器（heidolph）；高速冷凍離心機（Hettich）；氮吹儀（睿科儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

單標儲備液：精密稱取標準品1.0 mg，甲醇溶解，定容至10 mL，配制為100 μg·mL-1單標儲備液，置于 -18 ℃保存。

混合標準中間液：移取儲備液，用甲醇逐級稀釋成 10.0 μg·mL-1混合標準中間液。

標準曲線：移取混合標準溶液，用空白基質提取液配制成 0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和100.0 ng·mL-1系列濃度標準溶液。

1.3.2 樣品前處理

取適量可食部分，絞碎，均質，稱取均質樣2.0 g于離心管中，加4 g無水硫酸鈉，加入1%乙酸乙腈溶液8 mL，渦旋30 s，冰水浴超聲提取20 min，10 000 r·min-1離心 3 min，轉移上清液，再次往樣品加入8 mL1%乙酸乙腈，重復提取，轉移上清液并進行合并，水浴40 ℃氮吹至近干，加入1 mL20%甲醇水溶液，渦旋1 min，加入50 mg PSA和 50 mg C18，10 000 r·min-1離心 3 min，過 0.22 μm濾膜過濾。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。T3柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；進樣量：2.0 μL；流速：0.2 mL·min-1，柱溫箱：40 ℃；流動相：0.1%甲酸-2 mmol·L-1乙酸銨溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 洗脫梯度

（2）質譜條件。電噴霧離子源（ESI+）；MRM模式；氣簾氣30.0 psi；碰撞氣：9 psi；離子化電壓：4 500 V，源溫度：550 ℃；霧化氣壓力、輔助加熱氣壓力均為55 psi。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

本 文 考 察 了 色 譜 柱 C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）、RP18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 和 T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）對目標化合物分離度的影響。RP18柱對化合物磺胺類同分異構體的分離度較C18柱和T3柱差，磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪沒有完全分離；T3柱對磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶的分離優于C18柱。同時硝基咪唑、喹諾酮類在T3柱上均具有較好的分離效果。最終選擇色譜柱 T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）為分析色譜柱，見圖1。

圖1 不同色譜柱中3種磺胺的分離情況

2.2 質譜條件的優化

將1.0 ng·mL-1標準溶液直接注入串聯質譜儀，根據46種化合物相對分子質量及其帶電方式，進行一級質譜全掃描，得到母離子峰。對離子源電壓及噴霧氣壓進行調整至各化合物響應值穩定后，對母離子進行二級質譜掃描，得到46種化合物的子離子碎片信息，同時優化碰撞能量及RF透鏡電壓，選取2個特征離子進行分析，得到最優的質譜參數，優化參數見表2。

表2 46種化合物質譜參數

（續表2）

（續表2）

2.3 C18和PSA的優化

實驗考查C18、PSA及C18和PSA聯合使用對樣品凈化后回收率影響。QuEChERS常用的凈化填料主要有N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷（C18）、石墨化炭黑（Graphitized Carbon Black，GCB）等，GCB主要用于農藥殘留凈化，去除色素，C18主要作用于去除基質中脂肪干擾物，PSA主要作用于去除基質中脂類及糖類物質。本文對比50 mg PSA和50 mg C18的凈化效果。結果顯示，對于蝦中的磺胺類，C18的凈化效果整體優于PSA，C18的平均回收率為81%，PSA的平均回收率為69%，C18去除雜質能力更好。魚、蝦中C18和PSA對其他化合物的凈化效果相當，采用混合分散固相萃取吸附劑的凈化效果更好。最終選擇50 mg PSA+50 mg C18作為凈化填料。

2.4 線性范圍、線性方程及檢出限

標準曲線采用基質配標法，46種化合物在2～100 ng·mL-1具有良好的線性關系，相關系數r2均大于0.99。以3倍信噪比為方法檢出限，46種化合物的檢出限為0.6～6.0 μg·kg-1，結果見表3。

表3 46種目標化合物的線性、相關系數、線性范圍及檢出限

（續表3）

2.5 加標回收及精密度

對陰性樣品魚進行加標回收實驗，加標水平為5 μg·kg-1、10 μg·kg-1、50 μg·kg-1， 每 個 水 平 6 個 平行，測得魚中硝基咪唑類的回收率在60%～91%，磺胺類的回收率在60%～119%，喹諾酮類的回收率在60%～110%，相對標準偏差≤7%（n=6），滿足要求。

3 結論

本文建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測魚、蝦等水產品食品中磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類中46種獸藥殘留的分析方法。樣品經1%乙酸乙腈溶液提取，加入PSA和C18進行凈化，使用T3色譜柱進行分離，可以減少樣品雜質的干擾。實驗分別對前處理方法、色譜及質譜條件進行了比較和優化，極大地提高了多種獸藥殘留的檢測效率，滿足水產品中多種類獸藥風險篩查及安全監測的需要。