TTC在食品菌落總數中的應用研究

李人趙，吳江霞，付剛劍，唐從霞

（江中食療科技有限公司，江西九江 332020）

菌落總數是指食品檢樣經過處理，在一定條件下（如培養基、培養溫度和培養時間等）培養后，所得1 g或1 mL檢樣中形成的微生物菌落總數。目前，食品中菌落總數的測定一般采用《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2—2016）[1]中的平板計數瓊脂傾注法，由于食品基質的不同，對于某些特殊樣品（如米糊、米粉、奶粉等），此方法存在一定的局限性，如不進行優化容易造成較大的誤差。例如，在測定米糊的菌落總數時，由于糊片基質小，吸水膨脹形成糊狀，接種平板時會帶入大量糊片，傾注培養基后糊片呈白色或米黃色，與菌落形態、顏色相似或接近，導致樣品與菌落不易區分，在計數時容易將米糊和菌落混淆，造成計數結果出現偏差，影響結果的準確性。此外，部分菌落也會沿著米片生長或生長在米片內部，即使借助放大鏡依然很難準確計數[2]，只有經驗豐富的檢驗員才能準確無誤的計數。

2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyl-2HTetrazolium Chloride，TTC）的氧化態為無色，而嗜中溫性需氧菌在新陳代謝過程中產生的琥珀脫氫酶可以使無色的TTC被還原成不溶性的紅色三苯甲臜，即在平板計數瓊脂培養基中加入TTC，可以使菌落顯紅色[3]。本文對不同的TTC使用方法和使用濃度對測定菌落總數準確度的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

ACB-4A1超凈工作臺，新加坡藝思高科技有限公司（ESCO）生產；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌器、BPX-272電熱恒溫培養箱和BGZ-146電熱鼓風干燥箱，均為上海博迅實業有限公司醫療設備廠生產；PL602E電子天平和ML204T電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產；DK-98-11水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司生產；Scientz-11L拍擊式均質器，寧波新芝生物科技股份有限公司生產。

1.2 試劑及溶液

TTC：上海藍季生物；氯化鈉：西隴科學股份有限公司；平板計數瓊脂、無菌均質袋：北京陸橋技術股份有限公司；2%TTC溶液（稱取2.0 g TTC于100 mL棕色容量瓶中，加入少量蒸餾水使其溶解，再用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置于2～10 ℃冰箱中保存備用。使用前按照需要配制成適宜的濃度并滅菌備用）。

1.3 實驗方法

1.3.1 判定方法

（1）顏色的判定。通過肉眼觀察培養基及菌落的顏色。

（2）菌落總數的檢測。參照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2—2016）執行。①稱取25 g樣品置盛有225 mL稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1～2 min，制成1∶10的樣品勻液。②用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），在振蕩器上振搖均勻，制成1∶100的樣品勻液。③分別吸取1 mL上述2個稀釋度的樣品勻液于無菌培養皿內，每個稀釋度做兩個培養皿。同時，分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個無菌培養皿內作空白對照。④傾注15～20 mL冷卻至46 ℃左右的平板計數瓊脂培養基，并轉動培養皿使其混合均勻，水平放置待瓊脂凝固后，將平板翻轉，于 36 ℃ ±1 ℃條件下培養 48 h±2 h。

（3）結果判定。①標準值：以未添加TTC溶液的結果作為標準值；②偏差度（Z值）：表示結果與標準值的偏離程度，以“Z值=（檢測值-標準值）/標準值*100%”計算；③判定：當|Z值|≤5%，表明檢驗結果與標準值偏差較小，為可接受的偏差；當|Z值|＞5%，表明檢驗結果與標準值出現了偏離，為不可接受的偏差。

1.3.2 實驗設計

（1）TTC加入方式的確定。配制3瓶100 mL平板計數瓊脂培養基，培養基溶解后，其中1瓶（A號）不加2% TTC溶液，作為對照培養基；1瓶（B號）在滅菌前加入1 mL 2% TTC溶液，混勻；1瓶（C號）在滅菌后加入1 mL已滅菌的2% TTC溶液，混勻。分別觀察并記錄培養基的顏色，同時取同一份米糊樣品進行菌落總數檢測，觀察并記錄菌落形態。

（2）TTC溶液使用初步范圍的確定。配制7瓶500 mL平板計數瓊脂培養基，將培養基及15 mL 2%TTC溶液分別置于121 ℃高壓滅菌15 min。滅菌結束，待冷卻至（46±1） ℃時，分別向7瓶培養基加入經121 ℃高壓滅菌的2% TTC溶液0 mL、0.05 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.25 mL、2.50 mL和5.00 mL，搖勻。此時培養基中TTC的濃度分別為0%、0.000 2%、0.001 0%、0.002 0%、0.005 0%、0.010 0% 和0.020 0%[4]。使用這7瓶培養基分別對10份米糊樣品進行菌落總數檢測。其中以TTC添加濃度為0%的樣品作為對照培養基培養計數，觀察、記錄菌落形態并計數偏離度Z值。

（3）TTC溶液適宜使用范圍的進一步確定。配制7瓶500 mL平板計數瓊脂培養基，滅菌結束，待冷卻至（46±1） ℃時，按比例加入定量已滅菌的TTC溶液，使培養基中TTC的濃度分別為0.002%、0.002 5%、0.003 0%、0.003 5%、0.004 0%、0.004 5%和0.005 0%。使用這7瓶培養基對10份米糊樣品再次進行菌落總數檢測，以1.3.2（2）項下TTC添加濃度為0%的作為對照計數，觀察、記錄菌落形態并計數偏離度Z值。

2 結果與分析

2.1 不同順序加入TTC溶液的效果

經過對培養基和菌落形態顏色效果觀察，滅菌后加入TTC溶液最合適，結果見表1及圖1。

圖1 不同方式添加TTC的培養基及平板中菌落的顏色

表1 不同方式添加TTC對檢測的影響表

2.2 TTC溶液的使用初步范圍

由圖2可知，經過對菌落形態顏色觀察，當TTC溶液濃度低于0.002%時顯色效果不明顯，菌落呈淺紅色，個別菌落未染色成功。

圖2 不同TTC濃度的菌落形態顏色顯示效果

由表2及圖3可知，當TTC溶液濃度高于0.005%時，菌落結果呈下降趨勢，表明此濃度對菌落有抑菌作用[5]。偏離度|Z|值＞5%，表明該結果存在偏離，不宜采用。故TTC溶液初步使用范圍宜在0.002%～0.005%。

圖3 TTC濃度與平均菌落總數關系趨勢圖

表2 不同濃度TTC（0%～0.020 0%）對菌落總數的影響表

2.3 進一步確定TTC溶液的使用范圍

由表3和圖4可知，當TTC濃度高于0.003 5%時，菌落總數呈一定的下降趨勢，表明此濃度TTC對菌落總數有一定的抑菌作用，TTC濃度在0.004 0%～0.005 0%時，偏離度|Z|值在5.90%～10.40%，偏離度|Z|值＞5%，表明該結果存在偏離，不宜采用。結合2.2項下的結果建議TTC溶液的使用濃度為0.002 0%～0.003 5%

圖4 TTC濃度與平均菌落總數關系趨勢圖

表3 不同濃度TTC（0.002 0%～0.005 0%）對菌落總數的影響表

3 結論與不足

3.1 結論

①當TTC與培養基混合后再滅菌，不僅菌落會被染色，培養基也會被染色，從而影響菌落計數。因此，在實際檢驗時，TTC應與培養基分開滅菌，在使用前按比例添加至46 ℃左右的培養基中，混勻后使用。②TTC濃度＜0.002%時，菌落不顯色或顯淺粉色，在菌落計數時發現仍有部分菌落因未顯色而容易忽略，導致結果偏低；TTC濃度在0.002 0%～0.003 5%時，菌落顯明顯的紅色，可以很快點計菌落數，同時結果與未添加TTC的結果對照偏離值|Z|≤5%，差異很小，符合要求；當TTC濃度＞0.003 5%時，菌落總數與濃度呈反比趨勢，即TTC開始對菌落產生抑制作用，同時結果與未添加TTC的結果對照偏離值|Z|＞5%，差異相對明顯，結果偏離。故在食品菌落總數檢測中TTC溶液的最適宜添加濃度為0.002 0%～0.003 5%。③本研究為麥片類、米粉（米糊）類等食品的菌落總數檢測提供了科學可靠的優化方案，操作流程簡單，結果準確，可推廣性強。

3.2 不足

①自身顏色深的產品，如果粒橙、胡蘿卜汁等不宜添加TTC，容易導致菌落顯色與產品自身顏色混淆。②本文僅通過多次檢測數據對TTC溶液的抑菌濃度進行判斷分析，未經過菌種添加回收等方式研究計算高濃度TTC溶液對菌落總數的具體抑菌效果。