三華李紅色素的提取及抗氧化性的測定

劉艷燦，朱仕蘭，崔燕玲，賀勁鋒，高柔敏，許伊妍

（佛山職業技術學院，廣東佛山 528000）

三華李為薔薇科李屬植物，果實為圓形或近圓形，果皮淡紫色，果肉紫紅色[1]。因早在廣東韶關翁源縣三華鎮種植而得名，近年來廣東信宜“銀妃”三華李因果大、肉厚、汁甜、色美屢屢在國內省內名特優農產品展示和質量評比活動中獲譽[1]。研究表明，三華李的果實含有豐富的礦質元素（如鉀、鈉、磷、鎂、鋅和銅等）和維生素（如維生素A、維生素D、維生素B1和維生素B2等），且其有機酸含量和種類尤其豐富，對人體健康大有裨益[2-3]。

近年來，對三華李的產品加工主要集中在果肉制作，如腌制成蜜餞、制作成果糕、釀制果酒，但是對其剩余物的有效成分的綜合研究利用相對較少，如加工后剩余的果渣、果皮等[1,4-6]。這樣不僅造成果渣中有效成分的流失浪費，嚴重時還可能污染環境[7]。目前的報道中對三華李的果實果渣進行再利用提取其中天然色素的報道較少，本試驗選擇提取三華李紅色素，其主要成分為花青素，花青素屬天然的水溶性色素，主要存在于果皮、果肉中[8-10]。

近年來，由非法添加物導致的食品安全事故頻繁發生，人們普遍擔心人工合成色素的安全性。由此，針對從植物組織中提取的安全無毒的天然色素的研究得到了廣泛的關注[11-13]。花青素對植物具有重要的生理功能，還具有抗氧化活性，是一種優良的天然抗氧化劑和自由基清除劑，在食品、醫藥、化妝品等方面擁有較大的發展市場[14-16]。本試驗探究了三華李中紅色素的提取工藝，同時對粗提取物測定抗氧化活性，為進一步開發天然食用色素提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三華李品種為廣東省信宜市錢排鎮“銀妃”三華李；檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇、乙醚、水楊酸、過氧化氫、FeSO4溶液、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和L(+)-抗壞血酸和2,6-二叔丁基對甲酚（BHT），均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

1.3 試驗方法

1.3.1 提取工藝

三華李紅色素的提取工藝為果肉預處理→加入提取劑并搗碎→室溫酶解→抽濾得濾液→真空濃縮→紅色素濃縮液。

1.3.2 最佳波長的確定

根據前期預試驗得出，三華李紅色素最佳檢測波長為460 nm。

1.3.3 提取劑的選擇

取去核果肉加入料液比1∶1（m∶V）的提取劑[pH=4的緩沖溶液（檸檬酸鈉、磷酸）、pH=4的50%乙醇、pH=4的無水乙醇、磷酸鈉緩沖溶液和pH=4的乙醚]，搗碎后在室溫條件下放置20 min，抽濾并收集濾液，分別將濾液稀釋50倍在460 nm波長下進行吸光度值的測定，確定提取效果最佳的提取劑。

1.3.4 三華李紅色素提取條件的單因素試驗

盡管生物質能烤房設備烘烤煙葉燃燒的都是生物質。但由于不同設備對溫濕度控制的響應速度和協同運行效率不同，可直接影響整個烤房供熱設備的綜合熱效率，進而影響煙葉烘烤成本及推廣價值。從表2可知，單烤燃料消耗，常規燃煤烤房(CK)為727 kg，不同生物質能烤房為848～906 kg，生物質燃燒機烘烤煙葉消耗燃料比燃煤高，其主要原因是生物質顆粒的燃值低于煤炭的燃值。綜合熱效率，生物質燃燒機熱效率比燃煤烤房高13%～15%。不同類型的生物質烤房的熱效率各有差異，其中，T3最高，達51.9%；T2其次，為50.8%；T4最低，僅48.3%，但仍高于CK。

（1）料液比的確定。取等量三華李去核果肉加入不同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液并搗碎，在室溫條件下放置20 min，抽濾并收集濾液，濾液于60 ℃的旋蒸器上60 min，取得粗提物，分別將粗提取物稀釋50倍在460 nm波長下進行吸光度值的測定，確定提取效果最佳的料液比。

（2）放置時間的確定。分別取等量三華李去核果肉加入相同提取劑后搗碎，在室溫條件下放置0 min、10 min、20 min、30 min和40 min，抽濾并收集濾液，濾液于60 ℃的旋蒸器上60 min，取得粗提物，分別將粗提取物稀釋50倍在460 nm波長下進行吸光度值的測定，確定提取效果最佳的放置時間。

（3）放置溫度的確定。分別取等量三華李去核果肉加入相同提取劑后搗碎，在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃下放置一定時間，抽濾并收集濾液，濾液于60 ℃的旋蒸器上60 min，取得粗提物，分別將粗提取物稀釋50倍在460 nm波長下進行吸光度值的測定，確定提取效果最佳的放置溫度。

（4）旋蒸溫度的確定。分別取等量三華李去核果肉加入相同提取劑后搗碎，在一定溫度下放置一定時間，抽濾并收集濾液，濾液于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃旋蒸60 min，取得粗提物，分別將粗提取物稀釋50倍在460 nm波長下進行吸光度值的測定，確定提取效果最佳的旋蒸溫度。

（5）旋蒸時間的確定。分別取等量三華李去核果肉加入相同提取劑后搗碎，在一定溫度下放置一定時間，抽濾并收集濾液，在一定溫度下旋蒸40 min、50 min、60 min、70 min和80 min，取得粗提物，分別將粗提取物稀釋50倍在460 nm波長下進行吸光度值的測定，確定提取效果最佳的旋蒸時間。

1.3.5 三華李紅色素抗氧化性質研究

（1）羥基自由基（·OH）清除能力測定[17-18（]同時以抗壞血酸進行同樣處理作為參照）。將粗提物加入95%乙醇定容至10 mL，取樣品溶液1 mL，依次加入2 mL濃度為6 mmol·L-1的FeSO4溶液，再加入6 mmol·L-1H2O2溶液2 mL，充分混勻后室溫靜置10 min，加入2 mL新配制的6 mmoL·L-1水楊酸溶液并混勻，在37 ℃下放置30 min，在510 nm波長處測其吸光度值。同時進行空白（A0）和樣品對照（A1）處理，樣品溶液對羥自由基（·OH）的清除率的計算公式為

式中：A為試驗組（樣液+水楊酸）吸光度值；A1為對照組（樣液+空白溶劑）吸光度值；A0為空白組（水楊酸+空白溶劑）吸光度值。

（2）DPPH自由基清除能力測定。以95%的乙醇作為溶劑，將DPPH自由基配制成濃度為0.1 mmol·L-1的溶液，DPPH溶液要現配現用。取不同濃度的紅色素溶液各1.0 mL，加入等體積的DPPH溶液，充分混合，在室溫25 ℃下避光放置30 min，測定混合溶液在517 nm處的吸光度，以95%乙醇作為空白對照。再以BHT作為陽性對照，在相同條件下進行實驗[19]。DPPH自由基陽離子清除率計算公式為

2 結果與分析

2.1 提取劑的選擇

不同提取劑對三華李紅色素的提取效果的影響結果見表1。各類提取劑對三華李紅色素的提取效果為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液提取三華李紅色素的吸光度與色澤效果最好，溶液顏色呈紫紅色，與果肉顏色很貼近；磷酸鈉緩沖溶液在浸提中溶液色澤也接近原果肉色，但吸光度較低；50%乙醇和乙醚在浸提中濾液顏色與其他提取劑區別較大，為黃色和淡黃色，提取物可能多為黃酮類成分物質[7]。無水乙醇浸提后的溶液顏色比緩沖溶液浸提后的顏色偏淺，吸光度較低。因此，pH=4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液提取三華李紅色素的效果最好。

2.2 不同條件下三華李紅色素的提取的單因素試驗結果

2.2.1 料液比對三華李紅色素提取效果的影響

由圖1可知，料液比在1∶1時三華李紅色素的吸光度值最大。料液比小于1∶1時，果肉破碎不夠完全影響色素的有效提取。當料液比從1∶1到1∶3時，提取溶液的吸光度值急劇下降，而后呈緩慢下降趨勢，到1∶5時吸光度值的變化趨勢已比較平緩。可能是在超過合適的料液比后，增加提取劑的用量會稀釋提取出的三華李紅色素的濃度，導致吸光度值下降。而且過多的水分給后續的提取工作增加難度。因此，選擇料液比1∶1作為本試驗的最佳料液比。

圖1 料液比對三華李紅色素提取效果的影響

2.2.2 放置時間對三華李紅色素提取效果的影響

由圖2可知，放置時間在0～20 min時，提取效果變化不明顯，當放置時間增加到30 min后吸光值隨著放置時間的延長而減少，當放置時間為40 min時吸光度值急劇下降，與放置時間為20 min的提取效果差別不大。可能原因是放置時間較短時，三華李細胞未能充分吸水破裂導致色素成分無法釋放出來，當放置時間過長時反應酶與紅色素發生反應導致紅色素含量下降，提取液的吸光度值下降。因此，最佳放置時間為30 min。

圖2 放置時間對三華李紅色素提取效果的影響

2.2.3 放置溫度對三華李紅色素提取效果的影響

由圖3可知，隨著放置溫度的升高，提取液的吸光度逐漸上升，當溫度達到50 ℃時，吸光度達到最大。隨后，吸光度隨溫度的升高而下降。適宜的放置溫度能促進三華李中紅色素的溶出，溫度過高可能會導致色素分解或氧化。綜合考慮，選擇50 ℃作為三華李紅色素提取溫度，既可保證紅色素在此溫度下不被分解或被氧化，同時紅色素的浸出率較高。

圖3 放置溫度對三華李紅色素提取效果的影響

2.2.4 旋蒸溫度對三華李紅色素提取效果的影響

由圖4可知，旋蒸溫度在30～50 ℃時，吸光值隨溫度升高而升高。當旋蒸溫度到50 ℃時提取液的吸光度值達到最大。繼續升高旋蒸溫度，吸光度開始緩慢下降。這可能是因為旋蒸溫度較低時紅色素未能充分溶出，此時吸光度值較低，當旋蒸溫度過高時，屬于熱敏性物質的紅色素在高溫被結構破壞導致吸光度值下降。因此，最佳旋蒸溫度為50 ℃。

圖4 旋蒸溫度對三華李紅色素提取效果的影響

2.2.5 旋蒸時間對三華李紅色素提取效果的影響

由圖5可知，旋蒸50 min時吸光度值達到最大，50 min后吸光度值呈緩慢下降的趨勢。原因可能是在一定范圍內旋蒸時間的增加有利于紅色素的充分溶出，繼續增加旋蒸時間會使得溶出的紅色素在50 ℃的旋蒸溫度下逐漸被破壞分解。綜上，最佳旋蒸時間為50 min。

圖5 旋蒸時間對三華李紅色素提取效果的影響2.3 三華李紅色素抗氧化性的測定

2.3.1 三華李紅色素對羥基自由基清除能力的測定

由圖6可知，三華李紅色素與維生素C對羥基自由基的清除率在試驗濃度內均隨質量濃度的增加而增大。但相同濃度的維生素C對羥基自由基的清除能力比三華李紅色素強。綜上，三華李紅色素對羥基自由基有一定的清除能力。

圖6 三華李紅色素質量濃度對羥基自由基的清除效果

2.3.2 三華李紅色素對DPPH清除能力的測定

由圖7可知，隨著試驗濃度內質量濃度的增大，三華李紅色素與維生素C對DPPH的清除能力逐步提高。但相同濃度的三華李紅色素對DPPH的清除能力弱于維生素C的清除能力。綜上，三華李紅色素對DPPH有一定的清除能力。

圖7 三華李紅色素質量濃度對DPPH的清除效果

3 結論

本試驗以三華李為原料，提取的三華李紅色素是水溶性的天然色素。通過單因素試驗確定了三華李中紅色素的最佳工藝條件為以pH=4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液作為提取劑，料液比為1∶1，放置溫度50 ℃，放置時間30 min，旋蒸溫度50 ℃下旋蒸50 min。在此條件下提取液的吸光度值最高且溶液呈紫紅色。此外，三華李紅色素對羥基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）有較好的清除能力，可為三華李的綜合利用提供較好的研究基礎。