花椒總生物堿提取工藝及抗氧化活性研究

張文艷，陳 茜，李俊杰，趙仲霞

（昭通學院，云南昭通 657000）

花椒屬蕓香科，在全球范圍內大概有200多種，主要品種為青椒和花椒[1]。花椒屬植物主要活性成分為揮發油[2]、生物堿類化合物、香豆素[3]等。生物堿[4]是一類含氮有機化合物，具有抗氧化[5]、抗肥胖、抗糖尿病[6]、抗菌[7]等活性。花椒生物堿是花椒屬植物中普遍含有的一類物質[8]，花椒中被發現的生物堿主要有香草檸[9]、和帕洛平[10]、青椒堿[11]。生物堿的主要檢測方法有電位滴定[12]、紫外吸收、酸性染料比色[13]等，提取方法主要有水提取、氨-氯仿[14]、有機溶劑、超聲波等[15]。

青花椒在云南省的大部分地區均有分布和栽培[16]，昭通地區青花椒種植面積超過6.7萬 hm2，產量占全省的60%～70%[17]，主要分布在金沙江、牛欄江、關河、洛澤河流域[18]，海拔400～1 800 m的永善縣務基鎮、黃華鎮、大興鎮、馬口鎮，魯甸縣龍頭山鎮、梭山鄉，彝良縣角奎鎮、洛澤河鎮，巧家縣紅山鄉、大寨鄉等鄉鎮[19-20]。本文以昭通大關縣青花椒為原料，采用醇提法考察生物堿提取量，以DPPH、ABTS+為檢測指標，探究花椒生物堿的抗氧化作用，以期為昭通金江花椒作為天然抗氧化劑在食品中的進一步應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

青花椒（昭通大關縣）；白屈菜紅堿標準品（江蘇永健醫藥科技公司）；溴麝香草酚藍（成都科隆化學品有限公司）；無水乙醇、無水甲醇（天津風船化學試劑科技有限公司）；DPPH自由基清除能力試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）測試盒（南京建成生物工程研究所）；96孔板（NEST）；移液槍（大龍）；多功能酶標儀（Moleculart Devuces）；紫外分光光度計（日本島津公司）；超聲雙頻清洗機（寧海新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

參照姜華等[21]的方法，稱取60目花椒粉加入乙醇溶液，室溫避光浸泡24 h，設置溫度、時間進行超聲后回流提取2 h，收集濾液濃縮至浸膏狀備用。將花椒浸膏用無水乙醇配制一定濃度后，取200 μL于離心管中，加入相應濃度的乙醇溶液800 μL進行溶解，加入400 μL溴麝香草酚藍溶液，搖勻后加入2 mL三氯甲烷，靜置30 min，取三氯甲烷層進行測定。以相應濃度乙醇溶液做空白，在波長417 nm下用酶標儀檢測生物堿吸光值，根據標準曲線計算花椒中生物堿含量。

1.2.2 對照品的配制

稱取5.00 mg白屈菜紅堿標準品，加無水乙醇定容至25 mL混勻，即為0.2 mg·mL-1的對照品溶液。

1.2.3 測定波長的確定

取兩支比色管，加入200 μL對照品溶液、200 μL花椒生物堿浸膏液，加去離子水至1 mL后加入pH值為7.6的400 μL溴麝香草酚藍緩沖溶液，加入2 mL三氯甲烷后按照1.2.1方法進行測定。以酸性染料緩沖溶液的三氯甲烷為空白，進行全波長掃描。掃描結果如圖1所示，白屈菜紅堿與花椒生物堿在289 nm和417 nm處存在較高的吸收峰，結合后續標準曲線測定發現，417 nm下回歸方程相關系數R2較好，最終選擇417 nm為測定波長。

圖1 白屈菜紅堿與花椒生物堿全波長掃描圖譜

1.2.4 白屈菜紅堿標準曲線的繪制

分別取5只比色管標號，依次加入0 μL、200 μL、400 μL、600 μL、800 μL 白屈菜紅堿標準品后，加水至 1 000 μL，再分別加入 400 μL、pH 7.6的溴麝香草酚藍緩沖溶液，加入2 mL三氯甲烷振蕩2 min，按照1.2.1方法進行測定。空白為三氯甲烷酸性染料緩沖溶液，在417 nm處測定后作圖，得白屈菜紅堿標準曲線y=1.74x-0.002 5，R2=0.966 2，表明其具有良好的線性關系，可作為標準曲線使用。

1.2.5 花椒生物堿提取條件的確定

以花椒生物堿含量為檢測指標，探究乙醇濃度（%）、超聲時間（min）、超聲溫度（℃）、料液比（g∶mL）對花椒生物堿提取率的影響，確定最適的花椒生物堿提取條件。

1.2.6 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，正交試驗采用L9(34)的方法（表1）進行試驗，確定最佳生物堿提取工藝。

表1 正交試驗因素與水平設計

1.3 花椒生物堿活性檢測

1.3.1 DPPH自由基清除率的測定

參照試劑盒說明書，將花椒生物堿稀釋90倍后25 ℃避光反應30 min，在517 nm下檢測。清除率公式表示為

式中：A0為樣品測定吸光值；A1為樣品對照吸光值；A2為空白吸光值。

1.3.2 總抗氧化能力的測定

參照試劑盒說明書，將花椒提取液稀釋150倍后25 ℃反應6 min，在405 nm下檢測。

2 結果與分析

2.1 花椒生物堿提取條件的確定

2.1.1 乙醇濃度對花椒生物堿得率的影響

分別測定乙醇濃度65%、70%、75%、80%、85%對花椒生物堿得率的影響。由圖2可得，乙醇濃度在75%時，花椒生物堿得率最高。

圖2 乙醇濃度對花椒生物堿得率的影響

2.1.2 超聲時間對花椒生物堿得率的影響

分別測定超聲時間40 min、50 min、60 min、70 min、80 min對花椒生物堿得率的影響。由圖3可得，超聲時間為60 min時，花椒生物堿得率最高。

圖3 超聲時間對對花椒生物堿得率的影響

2.1.3 超聲溫度對花椒生物堿得率的影響

分別測定超聲溫度 10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃對花椒生物堿得率的影響。由圖4可得，超聲溫度為40 ℃時，花椒生物堿得率最高。

圖4 超聲溫度對花椒生物堿得率的影響

2.1.4 料液比對花椒生物堿得率的影響

分別測定料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35對花椒生物堿得率的影響。由圖5可得，料液比為1∶25時，花椒生物堿得率最高。

2.2 正交試驗設計

正交試驗設計與結果見表2。由表2中R值可知，乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時間4個因素對花椒生物堿得率的影響程度依次為料液比＞超聲溫度=超聲時間＞乙醇濃度。通過正交試驗分析，生物堿得率最高是 1.410 μg·mL-1，對應組合為A2B2C3D3，即乙醇濃度為75%、料液比（g∶mL）1∶25、溫度50 ℃、時間70 min。通過極差分析，生物堿最佳提取工藝為A2B2C1D1，即乙醇濃度為75%、料液比（g∶mL）1∶25、溫度30 ℃、時間50 min。因此進行了驗證試驗，結果表明，花椒生物堿提取工藝為A2B2C1D1時，得率 1.553 μg·mL-1，高于 1.410 μg·mL-1，即在乙醇濃度為75%、料液比（g∶mL）1∶25、溫度30 ℃、時間50 min的提取條件下，花椒生物堿得率最高。

表2 正交試驗及結果分析

2.3 花椒生物堿提取物抗氧化性檢測

分別按照DPPH和ABTS+自由基清除能力試劑盒方法制得以下標準曲線y=0.066 5x+0.040 4，R2=0.983 4和y=-0.638 3x+1.661 6，R2=0.990 1，均具有良好的線性關系，可作為標準曲線使用。花椒生物堿提取液對DPPH、ABTS+自由基的清除能力分別如下：稀釋90倍的花椒生物堿提取液的DPPH自由基清除能力為 642.937 5 μg Torlox/mL，比對照高15%；稀釋150倍的花椒生物堿提取液對ABTS+自由基的清除能力相當于18.47 mmol·L-1的Trolox溶液，比對照高8%，表明花椒生物堿提取液具有良好的抗氧化活性。

3 結論

本文對昭通金江花椒生物堿提取工藝及抗氧化作用進行研究，測定花椒生物堿在不同提取條件下生物堿得率的變化及抗氧化能力。結果表明，采用60目花椒，在乙醇濃度75%、料液比1∶25、超聲時間50 min、超聲溫度30 ℃的提取條件下，花椒生物堿得率最高，對DPPH自由基的清除能力達到642.9375 μg Torlox/mL，對 ABTS+自由基的清除能力相當于18.47 mM的Trolox溶液，表明其具有良好的抗氧化作用。