侵染番茄的苧麻花葉病毒分子特征及其基因序列分析

李 淳，劉學輝，卜昶棟，姚勝軍，王莉爽

（1.貴州省農業科學院植物保護研究所 貴陽 550006；2.貴州醫科大學生物與工程學院 貴陽 550025）

番茄是貴州發展蔬菜產業的重要作物之一，而病毒病是危害番茄生產的重要病害。目前，危害我國番茄生產的主要DNA病毒有番茄黃化曲葉病毒（，TYLCV）、廣東番茄黃化曲葉病毒（，ToYLCGDV）、中國番茄黃化曲葉病毒（，TYLCCNV）、泰國番茄黃化曲葉病毒（，TYLCTHV）、海南番茄曲葉病毒（，ToLCHNV）、中國番茄曲葉病毒（，ToLCCNV）、臺灣番茄曲葉病毒（，ToLCTWV）、煙草曲莖病毒（，TbCSV）和中國番木瓜曲葉病毒（，PaLCuCNV）9種。而目前我國尚未有苧麻花葉病毒（，RaMV）危害番茄的報道。因此，對這一新的番茄病毒的危害，應予以足夠的重視以確保我國番茄產業的健康良性發展。按照ICTV最新分類標準，苧麻花葉病毒是雙生植物真菌病毒目（）、雙生病毒科（）、菜豆金色黃花葉病毒屬（）成員，大多數菜豆金色花葉病毒屬病毒具有雙組分的基因組，即DNA-A和DNA-B，大小在2.5～2.8 kb之間。國內外對雙生病毒的研究主要集中在基因組結構、傳毒介體、傳播途徑與寄主的互作等方面。Chen等報道了苧麻花葉病毒在中國廣東地區侵染西番蓮。Peng等研究發現，苧麻花葉病毒對地中海型煙粉虱行為的改變存在性別差異，雌性煙粉虱的傳毒效率明顯高于雄性。SHEN等研究發現，蛋白激酶SnRK1的過量表達能使植物對雙生病毒的抗性增強，沉默SnRK1會增加雙生病毒的易感性，SnRK1還能直接磷酸化雙生病毒蛋白以減少感染。Kanakala等研究報道，煙粉虱親環素B（CypB）和熱休克70蛋白（hsp70）在病毒傳播途徑上與TYLCV在煙粉虱中腸內相互作用并共位點定位，這2種蛋白在病毒傳播過程中都有重要作用。目前，國內尚未見到苧麻花葉病毒侵染番茄的相關報道，明確該病毒的株系和變異情況對制定相關的防控策略具有重要的指導作用。筆者運用PCR擴增得到了RaMV的DNA-A和DNA-B，分析了該分離物與其他地區及其他作物上分離物的系統進化關系，并分析了不同地區RaMV各基因的核苷酸一致性，以期為科學防控RaMV提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病樣品采集與試驗 疑似番茄病毒病樣品于2019年秋季采自貴州省關嶺縣，品種為金石頭番茄D6689（來源于貴陽粒豐種子有限公司代理）。保存在-80℃冰箱。以未發病的健康番茄植株葉片作為陰性對照。試驗于2020年6—7月在貴州省植物保護研究所植物病理實驗室進行。

1.1.2 試劑 TransStartFastPfu DNA Polymerase、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、EasyPureQuick Gel Extraction Kit、2×EasyPCRSuperMix（Transgen biotech，AS111）、Trans2KPlus DNA Marker購自北京全式金生物有限公司；其他生化試劑及普通化學試劑均為進口或國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 番茄葉片樣本總DNA提取采用CTAB法。

1.2.2 PCR擴增與測序 采用劉勇等報道的通用引物BegoAFor1（5’-TGYGARGGICCITGYAARGTYCARTC-3’）和BegoARev1（5’-ATHCCMDCHATCKTBCTITGCAATCC-3’）進行番茄疑似病毒病樣品擴增，酶采用2×EasyPCRSuperMix。反應程序為95℃3 min；95℃15 s，50℃15 s，72℃1 min 12 s，35個循環；72℃5 min。

采用Li等設計的RaMV的DNA-A特異性引 物J4F（5'-CATGTATCGGAAGCCCAAGATG-3'）和J4R（5'-ATGGGCCTGTACGTCCAAGC-3'）擴增DNA-A，體系為Template 2μL，Forward Primer（10μmol·L）1μL，Reverse Primer（10μmol·L）1μL，TransStartFastPfu DNA Polymerase1μL，5X Trans-StartFastPfu Buffer10μL，Nuclease-freeWater 35μL，Total volume 50μL。反應程序為95℃3 min；95℃15 s，50℃15 s，72℃3 min，35個循環；72℃5 min。

設計了RaMV的DNA-B特異性引物RaMV-B-F（5'-TGATCAAGTCCCAGAGGAGATTGAATGC-3'）和RaMV-B-R（5'-AAGGACGATGATAAGAATGGACTGTAC-3'）擴增DNA-B，體系為Template2μL，Forward Primer（10μmol·L）1μL，Reverse Primer（10μmol·L）1μL，TransStartFastPfu DNA Polymerase 1μL，5×TransStartFastPfu Buffer 10μL，Nuclease-free Water 35μL，Total volume 50μL。反應程序為95℃3 min；95℃15 s，50℃15 s，72℃3 min，35個循環；72℃5 min。

PCR擴增產物經回收純化后克隆到pEASY-Blunt Simple Cloning Kit載體，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，經過菌落PCR鑒定后，選取陽性克隆進行測序，引物合成及測序由重慶擎科興業生物科技有限公司完成。

1.2.3 序列分析 利用DNAMAN和BioEdit對不同地區，不同作物上的RaMV的DNA-A和DNA-B及其編碼的各基因進行核苷酸序列相似性比較。運用MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建基于DNA-A和DNA-B全長核苷酸序列的系統發育進化樹，構建DNA-A和DNA-B系統發育進化樹采用的雙生病毒分離物序列來源見表1和表2。

表1 不同地區Begomovirus DNA-A分離物及其在國際基因庫中收錄的情況

表2 不同地區Begomovirus DNA-B分離物及其在國際基因庫中收錄的情況

2 結果與分析

2.1 疑似雙生病毒感染的樣品檢測

用雙生病毒通用引物BegoAFor1/BegoARev1對提取的總DNA進行擴增，得到1200 bp產物（圖1），回收后連接至T載體，克隆后送樣測序，經過Blast比對，確認其為RaMV序列。

圖1 番茄疑似Begomovirus樣品檢測

2.2 RaMV的DNA-A和DNA-B的全長基因組的克隆與序列分析

以J4F/J4R擴增DNA-A，得到大小2737 bp的條帶（圖2），以RaMV-B-F/RaMV-B-R擴增DNA-B，得到大小2709 bp的條帶（圖3），產物經回收、連接、克隆后送樣測序，比對結果表明，其序列為RaMV序列，具有菜豆金色花葉病毒屬病毒基因結構的典型特征。圖4顯示，該病毒DNA-A基因組具有6個開放閱讀框，病毒鏈上有AV1（編碼外殼蛋白CP）和AV2（編碼移動相關蛋白），互補鏈上AC1（編碼Rep蛋白，轉錄激活及復制相關），AC3（編碼REn蛋白，增強復制）和AC4（沉默抑制子）；圖5顯示，DNA-B具有2個開放閱讀框，病毒鏈有BV1（編碼核穿梭蛋白NSP），互補鏈有BC1（編碼運動蛋白MP）。

圖2 RaMV-GZDNA-A基因組擴增

圖3 RaMV-GZ DNA-B基因組擴增

圖4 SnaGene DNA-A全序列分析圖

圖5 SnaGene DNA-B全序列分析圖

對病毒編碼的DNA-A和DNA-B及各個基因進行核苷酸序列相似性比較（表3、4），結果表明，其DNA-A與各地的分離物的相似性相差不大，一致性在94.7%～95.5%之間，與RaMV-Zhejiang-Z1（FN396971）、RaMV-Jiangsu-J4（FN396969）和RaMV-Fujian（EF125190）的一致性都是95.5%；而體現在基因方面，則在AC2最為保守，一致性在96.3%～98.0%之間，與RaMV-Guangdong（KC171652）的一致性最高，達到了98%；在AV2變異性最高，一致性在91.9%～96.7%之間，RaMV-Guangdong（KC171652）的變異性最高，一致性為91.9%。DNA-B的相似性則相對低一些，一致性在90.4%～92.4%之間，最高為RaMV-Guangdong-Hn（KC171651）；BC1和BV1的一致性分別為91.2%～93.4%和91.6%～93.1%，一致性最高的都是RaMV-Guangdong-Hn（KC171651）。

表3 DNA-A及其編碼基因序列相似性比較 %

表4 DNA-B及其編碼基因序列相似性比較 %

2.3 RaMV的DNA-A和DNA-B的系統發育進化樹分析

為進一步分析貴州番茄RaMV-GZ分離物與已經報道的各RaMV分離物及其他的親緣關系，選取了來自國內8個地區的RaMV的DNA-A分離物，同時選取了國內外不同地區已經報道其他13類的DNA-A作為外組利用MEGA7.0軟件構建系統進化樹（圖6）。結果顯示，RaMV-GZ的DNA-A與中國其他地區的RaMV DNA-A序列都聚在一個小的分支上。同時，RaMV-GZ的DNA-A與的DNA-A親緣關系也較近。

圖6 基于Begomovirus DNA-A相似性構建的系統發育進化樹

選取了來自國內5個地區的RaMV的DNA-B分離物，以及國內外11類的DNA-B作為外組構建系統進化樹（圖7）。結果顯示，RaMV-GZ的DNA-B與中國不同地區的RaMV的DNA-B的序列都聚在一個小的分支上，其與及的親緣關系也較近。結合DNA-A的系統發育進化樹分析結果，貴州侵染番茄的RaMV與中國不同地區不同寄主的RaMV分離物的親緣關系較近，且地域差異不明顯。

圖7 基于Begomovirus DNA-B相似性構建的系統發育進化樹

3 討論與結論

據報道，RaMV的寄主有苧麻和煙草及西番蓮，而該病毒侵染番茄在我國未見報道。從結果分析，RaMV-GZ的DNA-A與已報道的RaMV分離物的一致性在94.7%～95.5%，DNA-B的一致性為91.2%～93.4%。在雙生病毒科病毒同源性比較中，同源性大于89%被認為是同一病毒的不同株系，在此基礎上，基因組序列同源性大于94%，則被認為是同一株系的不同分離物。因此，可以認為RaMV-GZ的DNA-B的變異較大，其能侵染番茄也可能是由于DNA-B的變異引起的，具體的機制有待進一步研究。

我國已報道的RaMV主要分布于江蘇、浙江、廣東等地，而在貴州番茄上的發現是屬于在新的地區新的作物上發現了該病毒。筆者通過PCR擴增得到了RaMV-GZ的DNA-A和DNA-B全長，并闡明了其基因組結構，通過Blast比對發現DNA-A與RaMV-Zhejiang-Z1（FN396971）、RaMV-Jiangsu-J4（FN396969）和RaMV-Fujian（EF125190）的一致性都是95.5%，DNA-B與RaMV-Guangdong-Hn（KC171651）一 致 性 為92.4%，通過構建系統進化樹確定該分離物DNA-A和DNA-B都屬于RaMV。從地域性差異來說，比較的幾個RaMV分離物雖然屬于不同地區，但相似性都比較高，都在90%以上，說明這些分離物可能有共同的來源。本試驗結果對貴州乃至西南地區RaMV的防控、抗病育種等工作具有重要意義。

雙生病毒的復合侵染是其遺傳重組的重要來源，同時也能加重侵染的癥狀。田間調查顯示非洲木薯花葉病毒（，ACMV）和東非木薯花葉病毒烏干達毒株（，EACMV-UG）復合侵染，2種病毒的協同作用引起木薯花葉病的大流行，導致了巨大的經濟損失。而RNA病毒和DNA病毒的復合侵染也會導致癥狀的加重，如番茄褪綠病毒（，ToCV）與TYLCV在山東及江蘇番茄上復合侵染導致番茄病毒病癥狀加重，且煙粉虱可同時攜帶這2種病毒傳播。在本試驗中筆者未發現DNA病毒或RNA病毒的復合侵染，但在同地區的其他樣品中檢測出了TYLCV和ToCV（本文中未顯示結果），不排除有復合侵染的可能性，應對此予以重視。

筆者首次對侵染貴州番茄的RaMV進行分子鑒定和序列分析，明確RaMV貴州分離物的分子特征，為RaMV在我國的傳播擴散、自然寄主鑒定和遺傳進化分析等方面研究提供了基礎，同時也為番茄抗病新品種的選育提供了科學依據。