1株優良生防細菌的篩選及其對甘肅溫室黃瓜枯萎病的防治效果

李 娜，李 晶，付麟雲，劉錦霞，丁 品，武建榮

（甘肅省科學院生物研究所 蘭州 730000）

黃瓜枯萎病由尖孢鐮刀菌黃瓜專化型（fsp）這一類真菌侵染，從苗期到結果期均會發病，開花結果期發病最為嚴重。發病初期，黃瓜植株上的葉片在中午高溫時出現萎蔫癥狀，早晚氣溫轉涼時，萎蔫癥狀又恢復正常。發病的中后期，植株上萎蔫的枝葉會逐漸增加，氣溫轉涼時癥狀也難以恢復，葉片出現由下向上逐步變得枯黃萎蔫，直至莖稈成水浸狀腐爛。黃瓜枯萎病主要經土壤傳播的維管束病害，露地和保護地栽培黃瓜上均可發生，連作地區尤為嚴重，現已成為世界范圍內影響黃瓜生產的毀滅性土傳病害。發病率在20%～30%，造成黃瓜產量下降，嚴重時在80%～90%，可導致黃瓜嚴重減產。目前，此病害己成為生產上制約黃瓜產量和品質的重要因素之一，而黃瓜是日光溫室反季節栽培的主要蔬菜種類，栽培面積已占日光溫室生產面積的50%以上。所以，此病害也成為制約現代農業發展的重要因素。

目前，農業生產主要就是采取田間輪作和植株嫁接的方法，還會使用和化學農藥相結合的方法來防治黃瓜枯萎病。但這些方法效果往往不穩定，化學農藥雖然可以有效控制溫室黃瓜枯萎病的發生，但長期使用化學農藥所產生的農藥殘留不僅污染土壤和地下水，也危害人畜健康，而且隨著內吸性殺菌劑大量使用，病菌易產生抗藥性，防效會逐漸降低。

如今，用生物防治的方法控制溫室黃瓜枯萎病越來越得到人們的關注和青睞。人們已經從土壤中篩選出多種有益微生物。其中，植物根際促生菌作為具有防病潛力和應用價值的一類生防菌受到國內外學者關注，并用于土傳病害的防治。目前，已報道對黃瓜枯萎病有生防潛力的拮抗菌包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、木霉屬真菌、鏈霉菌等，但有關弗雷德里克斯堡假單胞菌對黃瓜枯萎病菌的防控作用目前還未見報道。筆者從已分離鑒定的黃瓜根際微生物中檢測對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型具有較好拮抗作用的菌株，開展抗病試驗，為溫室黃瓜枯萎病防治的生物農藥開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

生防菌株：菌株F-2、33-1、F-4、N-2、N-Z、N-6、N-8、N-9，均為該實驗室分離，2018 年篩選于甘肅省武威市涼州區日光溫室黃瓜根際土壤。

供試病原菌：尖孢鐮刀菌黃瓜專化型（fsp）購于中國微生物菌種保藏中心。供試黃瓜：津育二號黃瓜。

供試藥劑：50%多菌靈可濕性粉劑。

培養基：牛肉膏蛋白胨培養基、PDA 培養基。

儀器：蘇凈安泰超凈工作臺SW-CJ-2 FD、上海申安立式高壓蒸汽滅菌鍋LDZF-50 L、上海森信霉菌培養箱。

1.2 方法

試驗于2018 年10 月在甘肅省科學院生物研究所實驗室開展。

1.2.1 拮抗菌株對尖孢鐮刀菌的抑制作用 采用牛津杯法將實驗室前期篩選出對尖孢鐮刀菌有一定抑制作用的菌株F-2、33-1、F-4、N-2、N-Z、N-6、N-8、N-9 接種在牛肉膏蛋白胨斜面培養基中，28 ℃恒溫活化48 h，活化后將8 種供試拮抗菌接在牛肉膏蛋白胨液體培養基中，28 ℃恒溫培養24 h。將尖孢鐮刀菌接在PDA 平板培養基中26 ℃恒溫活化96 h 后，將尖孢鐮刀菌孢子液均勻涂布在9 cm 的培養皿中，在培養皿中心放置內徑為6 mm 的牛津杯，每個牛津杯中分別加入8 種供試拮抗菌，在26 ℃恒溫培養箱中培養，設空白對照（無菌水處理），每株供試菌設3 次重復，待對照平板菌落長滿時測量抑菌圈大小，比較空白對照及各供試菌株病原菌菌落直徑，篩選對尖孢鐮刀菌拮抗性能良好的生防菌株。

1.2.2 拮抗菌發酵液對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制作用 采用菌絲生長速率法，測定菌株發酵產物的抑菌活性即發酵液對病原菌菌絲生長抑制作用。將拮抗細菌接入到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，28 ℃恒溫培養48 h，制成發酵液。將尖孢鐮刀菌接在PDA 平板培養基中26 ℃恒溫活化96 h。用200 μL 拮抗菌株F-2、33-1、F-4、N-2、N-Z、N-6、N-8、N-9 液體發酵液均勻涂在PDA 平板上，在平板中心放置5 mm 病原菌菌餅，以無菌水為對照，26 ℃下培養7 d，每處理設3 次重復，用十字交叉法測量病原真菌菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑×100%。

1.2.3 優良拮抗菌株鑒定 拮抗菌的鑒定用常規方法結合分子鑒定方法完成。

將拮抗效果最好的菌株33-1 進行革蘭氏染色、菌體形態、菌落形狀觀察；菌株生理生化反應參照《常見細菌系統鑒定手冊》中的方法。16 S rDNA測定是由上海基康生物技術有限公司完成并通過MEGA 7 軟件構建系統進化樹。

1.2.4 優良菌株33-1 對黃瓜枯萎病的防治及其促生效果 采用蘸根接種法測定優良菌株33-1 對黃瓜枯萎病的防治及其促生效果。將拮抗菌33-1接入牛肉膏蛋白胨液體培養基28 ℃培養2 d 備用，將病原菌尖孢鐮刀菌接種在PDA 液體培養基中26 ℃培養7 d，制成尖孢鐮刀菌菌懸液備用。將購買的津育二號黃瓜種子在45 ℃水中泡種1 h，之后經過70%酒精消毒1 min，HgCl消毒1 min，無菌水沖洗多次后放入培養皿中25 ℃催芽3 d，之后將芽根部劃傷，將劃傷的芽根部在之前培養好的尖孢鐮刀菌菌懸液中浸泡5 s，后接入育苗盤中，并將尖孢鐮刀菌菌懸液每穴6 mL 灌在距莖部1 cm 周圍，24 h后灌根接入拮抗菌33-1 液體懸浮液6 mL，拮抗菌菌液處理分B（原液）、A（10）、C（10）、D（10）、E（10）5 個濃度。每個處理30 個重復，并設有CK空白對照（不接病原菌）、CK（病原菌+清水）、CK 培對照（病原菌+培養基）、CK 藥劑對照（病原菌+50%多菌靈可濕性粉劑稀釋1000 倍）。溫度24～28 ℃，相對濕度50%～70%。30 d 后調查發病情況，統計病情指數、計算防治效果并測量植株株高、根長、總質量。黃瓜枯萎病分級標準見表1

表1 黃瓜枯萎病分級標準

植株發病程度及病情分級標準計算病情指數按公式（1）（2）進行計算。

病情指數/%=∑（病情級值×該病情級株數）/（病情最高級值×總株數）×100； （l）

相對防治效果/%=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100 。 （2）

1.3 數據分析

試驗數據用Excel 2007 和SPSS 23.0 統計分析軟件進行方差分析和顯著性水平檢驗。

2 結果與分析

2.1 高拮抗菌株篩選

牛津杯法篩選結果（表2）顯示，33-1 對尖孢鐮刀菌有較好的抑制作用，病原菌菌落直徑最小，F-2、N-Z 次之，N-6、F-4 對病原菌也有一定的抑制作用，N-8 的抑菌效果最差。

表2 拮抗菌株對尖孢鐮刀菌的抑制效果

菌絲生長速率法對比結果（表3）顯示，與對照比，8 種拮抗菌發酵液對病原菌菌絲生長均有極顯著抑制作用。其中，N-Z、N-6 和F-4 對病原菌菌絲生長有一定抑制作用，3 種拮抗菌沒有顯著性差異，抑菌效果相當。33-1 和F-2 和CK 相比較有極顯著差異，并且33-1 對病原菌菌絲生長抑制率可達64.65%，F-2 對病原菌菌絲生長抑制率可達55.81%，N-2、N-8 和N-9 對菌絲生長抑制率較低，均不超過30%，但三者間差異極顯著。由圖1 也可明顯看出8 種拮抗菌對病原菌菌絲生長抑制的差異。

表3 拮抗菌發酵液對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制作用

圖1 拮抗菌發酵液對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制作用

2.2 形態觀察、生理生化測定

挑選出對病原菌生長抑制率最高的拮抗菌株33-1，確定拮抗菌株33-1 是革蘭氏陰性，桿狀，運動，不產芽胞，菌落圓形隆起，邊緣整齊，濕潤，其生理生化特性與假單孢屬性狀吻合（表4）。菌株33-1為弗雷德里克斯堡假單胞菌。

表4 菌株33-1 的部分生理生化特性

2.3 拮抗菌防病能力

由圖表5 可知，在室內條件下，5 種處理較CK都降低了病情指數。其中，C 處理和D 處理病情指數最低，分別是5.36%和12.50%，D 處理與藥劑對照組效果相當，而C 處理植株發病程度明顯低于藥劑對照組14.28%，在防效上，C 處理和D 處理的效果也尤為突出，分別是86.95%和69.56%，C 處理更是明顯高于藥劑對照組65.23%的防治效果。在對株高的影響上，A 處理、C 處理、D 處理的株高高于CK。其中，C 處理的株高顯著高于CK，而C 處理與藥劑對照組沒有顯著差異，說明C 濃度可以促進植株生長，這個濃度在對促進植株生長與已經商品化的農藥效果相當。在對植株根長的影響上，A 處理、B 處理、C 處理、D 處理、E 處理均與CK、藥劑對照組無顯著差異，與空白對照組有極顯著差異，說明雖然各濃度菌劑沒有改善病原菌對植株根長生長的影響，但也沒有加劇病原菌對根長生長的抑制作用。從各濃度藥劑對植株總質量影響上來看，A處理、B 處理、C 處理、D 處理和E 處理的植株總質量都顯著高于CK，C 處理的植株總質量高于CK 和藥劑對照組，且差異極顯著，D 處理與藥劑對照組效果相當，說明5 種濃度藥劑對植株都有一定的增重效果，C 處理、D 處理效果尤為明顯。

表5 菌株33-1 室內盆栽防效試驗結果

3 討論與結論

在黃瓜生物防治的應用中，應用最多的有木霉屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬等，谷祖敏等研究發現采用拌土法接種長枝木霉THLJ 對黃瓜枯萎病的防治效果達67.05%。孫燕霞等使用解淀粉芽孢桿菌SYX-1 菌懸液對黃瓜枯萎病的防治效果為43.3%。圓圓等使用鏈霉菌S-101 發酵液對黃瓜枯萎病防效達到57.11%。假單胞菌屬是植物根系、根際最豐富的細菌類群，具有多樣的生物活性，假單胞菌廣泛存在于植物根際中。其中，許多菌株可以有效抑制多種真菌和細菌引起的根部病害，對植物的生長有促進作用，具有作為生防菌的有利條件，并能很好地發揮生防作用。關于假單胞菌在植物病害防治中，研究主要集中在熒光假單胞菌。熒光假單胞菌是植物根圍和土壤中常見的一種有益細菌，是目前研究最為廣泛的生防菌之一，但關于弗雷德里克斯堡假單胞菌的研究目前尚未見報道。

結合拮抗菌株和病原菌的平板對峙試驗、生防菌株發酵液抑菌活性的試驗，本試驗篩選出拮抗菌株弗雷德里克斯堡假單胞菌33-1，該菌能較好地抑制病原菌生長，對黃瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌黃瓜專化型菌株有較好的抑制作用，其發酵產物也能很好地抑制尖孢鐮刀菌菌絲生長，抑制率可達64.65%。33-1 的室內盆栽防病效果試驗結果表明，33-1 在C（10）拮抗菌發酵液濃度處理下植株發病程度明顯低于藥劑對照組14.28%和CK 對照組的41.07%，病情指數最低，為5.36%；在防效上，33-1在C（10）拮抗菌發酵液濃度處理下效果也尤為突出，防治效果為86.95%，更是明顯高于藥劑對照組65.23%的防治效果，說明C（10）拮抗菌發酵液濃度為33-1 室內盆栽防病效果最佳的拮抗菌發酵液濃度。拮抗菌33-1 在C（10）拮抗菌發酵液濃度處理下及D（10）拮抗菌發酵液濃度處理下，相對防治效果高于A（10）拮抗菌發酵液濃度處理及B（原液）處理，可能是因為高濃度的拮抗菌發酵液在土壤中對植株本身會產生一定影響，使得植株根系細胞受損，從而抵抗力降低，植株生長緩慢，株高、根長、總質量均低于空白對照組。培養基對照組處理下，植株全部死亡，可能是由于培養基養分充足，加快了病原菌尖孢鐮刀菌的生長。D（10）拮抗菌發酵液濃度處理下，相對防治效果和藥劑對照組相對防治效果相當。在與已經商品化的多菌靈比較，33-1 在C（10）拮抗菌發酵液濃度時，有效降低了黃瓜枯萎病的發病率，相對防治效果也高于已商品化的多菌靈；高于大部分假單胞菌對黃瓜枯萎病的67.5%的防治效果；更是高于目前研究較多的熒光假單胞菌的生防效率50%～60%。研究還表明這株弗雷德里克斯堡假單胞菌不僅具有抑菌活性作用，并在黃瓜苗期有顯著促生作用，其適宜濃度發酵液對苗期黃瓜植株有顯著促生作用。

綜上所述，弗雷德里克斯堡假單胞菌33-1 是1株綜合性狀優良的高效拮抗菌株，在防治土傳植物病害方面具有極大的潛力，可以為黃瓜枯萎病的防治及假單胞菌的高效利用提供菌株資源。下一步可以比較高效拮抗菌株33-1 活菌和代謝產物的抑菌能力，確定有效抑菌物質及其抑菌機制，為黃瓜枯萎病的防治及假單胞菌的高效利用奠定理論基礎，為黃瓜枯萎病的綠色防控提供重要的技術支撐。