甲基磺酸乙酯誘變西瓜種子的條件優化

趙 展，王曉婷，李 林，侯晟燦，霍治邦，張新成

（1.開封市農業物聯網工程技術中心·河南省高標準農田智能灌溉工程研究中心·開封大學信息工程學院河南開封 475004； 2.開封市農林科學研究院 河南開封 475004）

西瓜是我國重要的蔬菜型水果，因其品質好、瓤質細、抗病強等特點而深受消費者和生產者的喜愛和信賴，具有很重要的經濟價值。但在西瓜長期育種過程中，由于育種目標大多單一，使得西瓜種質資源的遺傳基礎越來越狹窄，進而使西瓜的產量、品質等重要性狀在生產上均受到較大限制；且單一化的種質資源也讓西瓜病害越來越嚴重，常給生產者帶來無法挽回的經濟損失。鑒于此，在西瓜遺傳育種過程中，利用現代育種技術和方法創新種質資源，拓寬其遺傳基礎就顯得尤為重要。

目前，利用物理誘變方法和化學誘變方法對作物進行誘變育種已成為選育新品種、創新種質資源的有效手段。化學誘變方法主要是利用化學誘變劑（如烷化劑、疊氮化物、堿基類似物等）對植物進行誘導變異，具有周期短、頻率高、范圍廣等特點，能夠在較短時間內獲得大量突變體材料，這些材料直接或間接地應用于新品種和新種質資源的選育。甲基磺酸乙酯（EMS，ethyl methanesulfonste）是一種高效穩定且應用廣泛的化學誘變劑，在誘變過程中，能夠使DNA 分子發生較多點突變，染色體畸變減少，并通過置換其他分子中的氫原子使得一些堿基烷基化而誘導突變。大量研究結果表明，要獲得良好的誘變效果，必須要有適宜的誘變劑量（誘變劑量=誘變液濃度×處理時間），通常把誘變處理后50.00%植株存活的劑量即半致死劑量作為選擇依據。弭寶彬等研究發現EMS 誘變冬瓜種子時最佳的誘變條件為1.20%EMS 誘變12 h，此時冬瓜種子發芽率、成苗率分別為54.67%、51.83%，接近半致死劑量。黃東福等對農作物EMS 的誘變條件進行分析后表明大部分作物的EMS 誘變半致死劑量在1.00%以內，且處理時間集中在4～8 h 時，可以獲得較好的誘變效果。

以開封市農林科學研究院的高代自交系石紅為研究材料，采用6 個處理濃度（0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%）和5 個處理時間（4、10、12、14、16 h）相互組合的方式，對西瓜種子進行了EMS 誘變最佳條件的篩選，通過對誘變處理后種子的發芽率和相對發芽率進行分析，獲得EMS誘變西瓜種子的最佳誘變劑量，為構建西瓜突變體庫，創制新的種質資源，進而深入研究西瓜的基因組和拓寬西瓜的遺傳背景奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試西瓜材料為高代自交系石紅，由開封市農林科學研究院西瓜研究所提供。EMS 誘變劑（水劑）購自Sigma 公司。試驗于2020 年7 月26 日至8 月初在開封大學信息工程學院農業物聯網協同創新中心農業基礎實驗室進行。

1.2 方法

1.2.1 EMS 溶液的配制方法 EMS 誘變劑用pH 7.0 的0.1 mol·L磷酸緩沖液配制成0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%的溶液。

1.2.2 EMS 的處理方法 西瓜種子誘變前設計2種種子處理方式：指甲刀切口和不切口。將切口和不切口的西瓜種子對EMS 的敏感性進行測試：用0.40%和1.00%的EMS 溶液分別處理切口和不切口的西瓜種子各4 h 和10 h。每個處理用50 粒種子，3 次重復。

確定最佳的種子處理方式后，將試驗設誘變濃度和誘變時間2 個因素，采用二因素完全隨機區組設計方法，因素1 為EMS 誘變濃度，設6 個濃度水平，即0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%；因素2為誘變時間，設5 個誘變時間水平，即4、10、12、14、16 h。試驗共30 個處理，3 次重復，每個處理用50粒種子。試驗處理均以pH 7.0 的0.1 mol·L磷酸緩沖液處理作為對照，誘變結束后，用1.0 mol·L的硫代硫酸鈉溶液終止反應，接著用0.1 mol·L的硫代硫酸鈉溶液沖洗，再用蒸餾水清洗3 遍，將種子平鋪于濾紙上瀝水，后用紗布包好放置于28 ℃恒溫培養箱中催芽。

1.2.3 測定發芽率 分別統計7 d 后的種子發芽數，計算發芽率和相對發芽率，篩選出EMS 溶液的半致死劑量，確定最佳的EMS 誘變濃度和時間。

發芽率=發芽種子數/供試種子數×100%，相對發芽率=處理的實際發芽率/對應CK 的實際發芽率×100%。

1.3 數據處理

采用Excel 2016 處理試驗數據并分析作圖，使用IBM SPSS 22.0 統計軟件采用LSD 法分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 EMS溶液對西瓜種子切口與不切口的影響

利用切口與不切口2 種處理方式對EMS 誘變西瓜種子的敏感性進行檢測后發現（表1），0.40%的低濃度處理下，處理時間為4 h 時，與對照相比，切口與不切口2 種處理方式對西瓜種子的實際發芽率和相對發芽率無影響，都是100%；但當濃度為0.40%，處理時間為10 h 時，切口西瓜種子的實際發芽率和相對發芽率都比對照顯著降低了4.00%，而不切口種子的實際發芽率和相對發芽率與對照相比無變化；當誘變濃度為1.00%，處理時間為4 h時，2 種處理方式對西瓜種子的實際發芽率和相對發芽率都無顯著變化；但當濃度為1.00%，處理時間為10 h 時，種子切口的處理方式使西瓜種子的實際發芽率和相對發芽率都分別比對照顯著下降了20.00%，而不切口的處理方式下西瓜種子的實際發芽率和相對發芽率僅下降了3.33%。由此可見，當誘變濃度較低且誘變時間較短時，種子不管是切口還是不切口對EMS 誘變劑都不敏感；當誘變濃度和誘變時間達到一定程度時，相同條件下，種子進行切口處理能夠顯著提高西瓜種子對EMS 誘變劑的敏感性。

表1 不同種子處理方式對西瓜種子發芽率的影響

2.2 誘變時間和誘變濃度對西瓜種子發芽率的影響

2.2.1 誘變時間對西瓜種子發芽率的影響 相同誘變濃度條件下，研究誘變時間對西瓜種子發芽率的影響（表2）發現，當誘變濃度為0.40%時，誘變時間分別為4、10、12 h 的西瓜種子相對發芽率與對照相比無顯著差異，而誘變時間為14 h 和16 h 時的西瓜種子相對發芽率分別比對照顯著降低了7.34%和11.78%；當誘變濃度分別為1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%時，誘變10、12、14、16 h 的西瓜種子相對發芽率均低于誘變4 h 的相對發芽率，且均達到了顯著水平。以上結果表明，誘變濃度和誘變時間對西瓜種子的發芽率都有較大影響，當誘變濃度較低為0.40%時，誘變時間在短期內對西瓜種子發芽率的影響效果差異不明顯，但超過一定時間后有顯著的影響效果；當誘變濃度≥1.00%時，誘變時間≥10 h 的影響效果均顯著低于誘變時間為4 h 的誘變效果。

表2 同一濃度下不同誘變時間對西瓜種子發芽率的影響

2.2.2 誘變濃度對西瓜種子發芽率的影響 相同誘變時間條件下，研究EMS 的誘變濃度對西瓜種子發芽率的影響發現，當誘變時間為4 h 時，誘變濃度為0.40%和1.00%的西瓜種子相對發芽率與對照相比無顯著差異，而誘變濃度分別為1.20%、1.40%、1.60%和2.00%的西瓜種子相對發芽率均顯著低于對照（圖1）；當誘變時間為10 h 和12 h 時，誘變濃度為0.40%的西瓜種子相對發芽率與對照相比均無顯著變化，但1.00%～2.00%的西瓜種子相對發芽率都比對照低，且都達到了顯著水平（圖2、圖3）；誘變14 h 和16 h 時，誘變濃度0.40%～2.00%的西瓜種子相對發芽率都顯著低于對照（圖4、圖5）。由此可見，誘變時間和誘變濃度協同影響EMS 的誘變效果，誘變時間一定時，誘變濃度越高西瓜種子的相對發芽率越低；與對照相比，誘變時間較短、誘變濃度較低時對西瓜種子相對發芽率的影響不大，誘變濃度越高，影響越顯著；當誘變時間較長時，低濃度的誘變效果依然不顯著，但隨著誘變濃度的增大，影響效果越來越明顯，且均能夠達到顯著水平；當誘變時間足夠長時，即使誘變濃度較低，誘變效果也較顯著。

圖1 不同EMS 濃度誘變4 h 對西瓜種子相對發芽率的影響

圖2 不同EMS 濃度誘變10 h 對西瓜種子相對發芽率的影響

圖3 不同EMS 濃度誘變12 h 對西瓜種子相對發芽率的影響

圖4 不同EMS 濃度誘變14 h 對西瓜種子相對發芽率的影響

圖5 不同EMS 濃度誘變16 h 對西瓜種子相對發芽率的影響

2.3 最佳誘變濃度和誘變時間的確定

最佳誘變劑量（包括誘變濃度和誘變時間）才能夠達到最佳的誘變效果。本試驗利用6 個誘變濃度和5 個誘變時間共30 個組合對EMS 誘變西瓜種子的劑量效應進行了分析（表2 和圖1），當誘變濃度為1.20%，誘變時間分別為12、14、16 h 時，西瓜種子相對發芽率分別為50.38%、52.21%和51.97%；當誘變濃度為1.40%，誘變時間分別為12、14、16 h 時，西瓜種子相對發芽率分別為48.95%、49.97%和48.82%。由上述結果可知，當誘變濃度為1.20%～1.40%、誘變時間為12～16 h 時，西瓜種子的相對發芽率能夠達到半致死劑量，以誘變濃度越低和誘變時間越短為最好的原則，獲得最佳的誘變組合為誘變濃度1.20%、誘變時間12 h。

3 討論和結論

最佳的誘變劑量是獲得最佳突變頻率，得到理想突變體的關鍵。而合適的誘變材料處理方式是降低誘變劑使用量和縮短誘變時間進而獲得最佳誘變劑量的重要措施之一。康保珊等在利用EMS誘變瓠瓜種子的研究中發現，利用1.00% 的EMS誘變濃度誘變12 h，不開殼種子的相對發芽率能夠達到99.20%，但開殼種子的相對發芽率卻下降到了46.00%左右，對EMS 誘變的敏感性顯著提高。在其他葫蘆科作物中，甜瓜種子不切口且EMS 處理濃度在1.00%～3.00%之間的發芽率能夠達到97.00%以上。本試驗發現對西瓜種子進行不切口處理時，1.00%的誘變濃度下即使誘變時間達到10 h，種子相對發芽率依然能夠達到96.67%，而切口處理后該條件下的種子相對發芽率下降到了80.56%，與前人研究結論類似，也進一步說明在進行EMS 誘變處理中，可以通過種子切口或者開殼的處理方式來提高種子對誘變劑的敏感性。

目前，關于是否存在低濃度、短時間的EMS 處理對植物種子或者幼苗有一定的促進作用還沒有統一定論。李雪寶等研究表明低濃度的EMS 能夠促進水稻種子的發芽勢及幼苗生長發育。霍雅馨等在箭筈豌豆中發現EMS 的短時處理能夠促進其幼苗生長。康保珊等在瓠瓜中發現低濃度、短時間的EMS 誘變處理能夠促進開殼瓠瓜種子發芽率的提高。但王春語等在分析EMS 處理高粱種子的最佳誘變劑量中發現隨著EMS 誘變時間的增長和EMS 誘變濃度的增加，高粱出苗率呈現出逐漸降低的趨勢。孔德培等在棉花中也發現EMS 對棉花種子的萌發有抑制作用，EMS 濃度越大，處理時間越長，對種子發芽勢和活力的抑制作用越顯著。本試驗中低濃度、短時間的EMS 處理后西瓜種子的相對發芽率與對照相比有所降低，但差異不顯著。此外，多數研究也表明，高濃度的EMS 處理短期內會對細胞造成無法完全修復的生理損傷，并抑制植株的生長發育。本試驗中同樣發現高濃度的EMS 條件下，即使誘變時間較短也能夠顯著降低西瓜種子的相對發芽率。

EMS 是一種高效、穩定的化學誘變劑，具有成本低、操作簡單、點突變頻率高，而染色體畸變頻率低等特點，且EMS 誘變多為顯性，易于突變體篩選。目前，利用EMS 誘變來創新種質資源已在不同作物育種中有了廣泛應用，但在該過程中，篩選出最佳的誘變劑量是獲得最佳的誘變效果的前提。通常是以半致死劑量為標準，一般以50%的種子相對發芽率作為半致死劑量的指標。殷冬梅等以半致死劑量為選擇標準，確定了2 個花生品種的最佳誘變組合，分別是中花5 號的0.90%誘變7 h 和1.20%誘變5 h，遠雜9102 的0.60%誘變7 h和0.90%誘變7 h，不同品種最佳誘變組合不同。孔德培等利用EMS 誘變亞洲棉發現0.60%的EMS溶液處理8 h 時其種子的發芽率和發芽指數分別為51.00%和18.84，該組合下的誘變效果最佳。康保珊等對開殼瓠瓜種子的24 個濃度/時間處理組合的研究中，發現1.00%～2.00%的EMS 誘變濃度為瓠瓜最適宜誘變濃度，在此濃度范圍內，誘變8～12 h 可達到半致死劑量，提高濃度需要相應縮短誘變時間。王學征等利用EMS 誘變西瓜種子發現1.80% 6 h 的組合、1.00% 9 h 的組合、1.40% 9 h 的組合和1.00%12 h 的組合發芽率均接近50%，并最終確定EMS 的最佳誘變條件為處理濃度1.00%且誘導時間9 h。本試驗以半致死劑量為標準，通過6個誘變濃度和5 個誘變時間共30 個誘變處理組合發現，EMS 誘變濃度為1.20%～1.40%，誘變時間達到12 h～16 h 的組合都能夠使西瓜種子相對發芽率達到50.00%左右，但以誘變濃度越低和誘變時間越短為原則獲得最佳的誘變組合為誘變濃度1.20%和誘變時間12 h。本試驗結果與王學征等的試驗結果相比誘變濃度增大，誘變時間延長，出現該問題的原因可能是西瓜品種以及西瓜自身基因型的不同造成的。

大量研究已經證實，最佳的EMS 誘變條件有利于獲得最佳的誘變效果，對于構建突變體庫、篩選突變體材料有重要的作用。目前，關于西瓜EMS 誘變條件和誘變效果的研究相對較少，具體的誘變機制仍處于探究階段。本試驗中利用誘變濃度和誘變時間的不同處理組合，篩選到了EMS 誘變西瓜種子的最佳誘變劑量，為西瓜突變體庫的構建和突變體材料的篩選提供了基礎，但該條件下能否獲得滿意的變異率還有待進一步的驗證。