大棗不同炮制品的薄層色譜研究*

劉世軍，帕合熱葉·卡哈爾，張 娛

陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化協同創新中心/秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室（培育）/陜西省創新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083

大棗為鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實［1］。具有補中益氣、養血安神、緩和藥性等功效［2］。現代藥理學研究表明，大棗具有抑制腫瘤、抗氧化、保肝、抗過敏、增強肌力、鎮靜、抗壓、抗衰老等作用［3-5］。大棗中所含的環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)和環磷酸鳥苷（cyclic guanosinc monophosphate，cGMP）活性成分有抑菌保肝、抗心律失常、降低血糖和血清膽固醇［5］等作用。

現代研究表明，大棗含有多種有效成分。例如，大棗果實含有生物堿：光千金藤堿、吡咯烷生物堿、巴婆堿；三萜酸類：白樺酯酸、齊墩果酸、馬斯里酸（山楂酸）；皂苷類：大棗皂苷、酸棗皂苷；黃酮類：蕓香苷（蘆丁）；脂肪酸：油酸［6］等。2015 版《中華人民共和國藥典》以齊墩果酸、白樺酯酸為對照控制大棗質量。大棗因產地、生長環境和采摘條件的不同，其化學成分會發生一定變化。本試驗采用薄層色譜法（TLC）對大棗中的三萜類成分白樺酯酸、齊墩果酸和其他成分進行色譜分析，探索大棗的炮制原理。

1 材料

1.1 儀器C21-HT2109 型多功能電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）；WF-H201B 紫外透射反射儀（上海精科實業有限公司）；KQ3-00DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公祠）；100×100 雙槽層析缸、硅膠G 薄層板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司）。

1.2 材料大棗（新疆大棗，產地新疆托克遜），白樺酯酸（陜西樂博生化科技有限公司，批號：16072201），齊墩果酸（陜西樂博生化科技有限公司，批號：16051205），石油醚（60～90℃，天津市天力化學試劑有限公司），甲苯（洛陽昊華化學試劑有限公司），乙酸乙酯（天津市天力化學試劑有限公司），冰醋酸（天津市天力化學試劑有限公司），甲酸（天津市科密歐化學試劑有限公司），三氯甲烷（成都市科隆化學品有限公司），丙酮（成都市科隆化學品有限公司）。

2 方法與結果

2.1 大棗炮制品的制備按《中藥大辭典》［6］中大棗的炮制方法，自制不同時間下大棗的清蒸炮制品。取大棗洗凈，置蒸籠內，加熱蒸制，取出干燥。見表1。

表1 大棗樣品炮制方法與性狀觀察

2.2 對照品溶液的制備精密稱取白樺酯酸0.0100g，齊墩果酸0.0100 g，各加乙醇10 mL，超聲處理30 min制成1 mL含1 mg的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 供試品1 的制備 取大棗生品1.0134 g，清蒸（15 min）1.0186 g，清蒸（30 min）1.0055 g，清蒸（45 min）1.0113 g，清蒸（60 min）1.0734 g，各加石油醚10 mL，浸泡10 min，超聲處理15 min，濾過，藥渣加無水乙醚10 mL，浸泡1 h，超聲處理15 min，濾液濃縮至1 mL。

2.3.2 供試品2 的制備 取大棗生品1.0659 g，清蒸（15 min）1.0754 g，清蒸（30 min）1.0401 g，清蒸（45 min）1.0128 g，清蒸（60 min）1.0661 g，各加水20 mL，超聲處理15 min，加鹽酸0.7 mL，加熱水解1 h，濾過，濾液濃縮至10 mL，用乙酸乙酯振搖提取兩次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解。

2.3.3 供試品3 的制備 取大棗生品2.0162 g，清蒸（15 min）2.0148 g，清蒸（30 min）2.0158 g，清蒸（45 min）2.0163 g，清蒸（60 min）2.0129 g，各加甲醇20 mL，浸泡10 min，超聲處理15 min，濾過，濾液濃縮至2 mL。

2.4 預試驗

2.4.1 供試品1 分別吸取供試品1溶液10 μL，對照品溶液各4 μL，點于薄層板上，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶冰醋酸，分別按a（14∶3∶0.5）、b（16∶4∶0.5）、c（16∶5∶0.5）3 種比例展開，觀察斑點。見圖1。

圖1 供試品1的薄層色譜圖

2.4.2 供試品2 分別吸取供試品2溶液10 μL，分別點于薄層板上，展開劑為三氯甲烷：丙酮，分別按a（8∶0.5）；b（4∶1）；c（10∶0.5）3 種比例展開，觀察斑點。見圖2。

圖2 供試品2的薄層色譜圖

2.4.3 供試品3 分別吸取供試品3溶液10 μL，對照品溶液4 μL 分別點于薄層板上、展開劑為石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸，分別按a（4∶0.5∶3滴）、b（4∶1∶0.5）、c（5∶1∶3 滴）3 種比例展開，觀察斑點。見圖3。

圖3 供試品3的薄層色譜圖

2.5 供試品的薄層層析

2.5.1 供試品1 吸取供試品1 約10 μL 點樣，在薄層板上依次點1 生品、2 清蒸大棗（15 min）、3清蒸大棗（30 min）、4 清蒸大棗（45 min）、5 清蒸大棗（60 min）、6 齊墩果酸、7 白樺酯酸對照品溶液，以甲苯∶乙酸乙酯∶冰醋酸（16∶5∶0.5）為展開劑，展開完全后，用10% 硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點顯色清晰，在日照和紫外光365 nm 下觀察斑點。見圖4。

圖4 供試品1的薄層鑒別圖譜

由圖4可以看出，供試品1在日照下圖譜中共有8個清晰且分離度較好的斑點；在紫外光365 nm下共有8 個清晰的斑點；圖4 中可以確定e、f 兩個化合物分別為齊墩果酸、白樺酯酸。

日照下圖譜：與大棗生品比較，2（清蒸15 min）的a、b兩點較深，e、g、h 4個點較淡；3（清蒸30 min）的b、c、d、e、f、g、h 7 個點較深，a 點較淡；4（清蒸45 min）的b、c、d、g、h 5 個點較深；5（清蒸60 min）的b、c、d、f、g、h 6個點較深。不同時間清蒸大棗比較，3（清蒸30 min）的b、c、d、e、f、g 6個點最深。

紫外光365 nm：與大棗生品比較，2（清蒸15 min）的g、h 兩個點較深，b 點較淡；3（清蒸30 min）的g點較深，d、e兩個點較淡；4（清蒸45 min）的c、e、g、h 4個點較深；5（清蒸60 min）的c、d、e、f、g、h 6個點較深。不同時間清蒸大棗相比：5（清蒸60 min）的d、e、h3個點較深。

2.5.2 供試品2 吸取供試品2約10 μL點樣，在薄層板上依次點1 生品、2 清蒸大棗（15 min）、3 清蒸大棗（30 min）、4 清蒸大棗（45 min）、5 清蒸大棗（60 min），以三氯甲烷∶丙酮（10∶0.5）為展開劑、展開完全后用10%硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點顯色清晰，在日照和紫外光365 nm 下觀察斑點。見圖5。

圖5 供試品2的薄層鑒別圖譜

由圖5可以看出，供試品2在日照下圖譜中共有6個清晰且分離度較好的斑點；在紫外光365 nm下圖譜中共有5個清晰且分離度較好的斑點。

日照下圖譜：與大棗生品比較，2（清蒸15 min）的a、b 2個點較深；3（清蒸30 min）的a、b、c、d、f 5個點較深；4（清蒸45 min）的b、e、f 3 個點較深；5（清蒸60 min）的b、f 2個點較深；a、c、e 3個點較淡。不同時間清蒸大棗相比：3（清蒸30 min）的a、b、c、d 4個點最深；4（清蒸45 min）的e、f 2個點最深。

紫外光365 nm：與大棗生品比較，2（清蒸15 min）的c、d 2個點比較深；3（清蒸30 min）的c、e 2個點較深；4（清蒸45 min）的c、e 2 個點較淡；5（清蒸60 min）的e 點較深。不同時間清蒸大棗比較，3（清蒸30 min）的c、e 2個點最深；4（清蒸45 min）的c、e 2個點最淡。

2.5.3 供試品3 吸取供試品3 約10 μL 進行點樣，并在薄層板上點1生品、2清蒸大棗（15 min）、3 清蒸大棗（30 min）、4 清蒸大棗（45 min）、5 清蒸大棗（60 min）及齊墩果酸對照品溶液，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸（4∶1∶0.5）為展開劑，展開完全后用10%硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點顯色清晰，在日照和紫外光365 nm下觀察斑點。見圖6。

圖6 供試品3的薄層鑒別圖譜

由圖6可以看出：供試品3在日照下圖譜中共有5 個清晰且分離度較好的斑點；在紫外光365 nm下共有5個清晰且分離度較好的斑點，圖6中可以確定c為齊墩果酸。

日照下圖譜：與大棗生品比較，2（清蒸15 min）的a、c 2個點較深；新出現了d、e 兩個點；3（清蒸30 min）的a、c 2個點較深；4（清蒸45 min）的a 點較淡；5（清蒸60 min）的c點較深；a、b 2個點較淡。不同時間清蒸大棗相比：2（清蒸15 min）的a、c 2個點最深，出現了d、e兩個新點。

紫外光365 nm：與大棗生品比較，2（清蒸15 min）的a、b、c 3個點較深，新出現了d、e 2個新點；3（清蒸30 min）的a、b、c 3個點較深；4（清蒸45 min）的c點較淡；5（清蒸60 min）的a、b、c 3個點較深。不同時間清蒸大棗比較2（清蒸15 min）的a、b、c 3個點最深；出現了d、e 2個新點。

3 結論

薄層色譜是一種分離速度快，應用廣泛的色譜分析方法，其特點是可以同時分離多個樣品，分析成本低［8-9］，是目前《中華人民共和國藥典》中記載最多的鑒別與有關物質檢查方法之一，用于藥物中雜質的檢查和藥物分析［10］。本試驗為設備、試驗成本和技術要求高的學術研究提供了較大研究空間，節約了人力、物力和財力。

該試驗用薄層色譜法鑒別大棗不同炮制時間有效成分的變化，并對不同炮制時間的大棗建立了薄層鑒別特征圖譜。該圖譜可以區分生大棗和清蒸大棗，也可以區分不同炮制時間下的清蒸大棗，而且根據圖譜中斑點的顏色變化粗略判斷大棗的炮制程度。供試品1和供試品2的薄層色譜鑒定結果與《中藥大辭典》大棗清蒸30 min結果一致。

本試驗采用不同提取方法，用薄層色譜對大棗的不同清蒸品有效成分的變化進行研究。預試驗簡便，能快速確定展開條件，但在試驗過程中容易出現邊緣效應，影響色譜效果，導致斑點分離度不好，拖尾。試驗過程需要不斷調節展開條件，保證預飽和，這樣可以解決邊緣效應以及斑點的分離度，預防拖尾。由于大棗對照品的缺失和得到困難，我們無法判斷薄層色譜中每個點代表什么成分，但是我們可以判斷大棗在炮制前后化學成分發生了一定變化，這可以為大棗的炮制以及其他中藥材炮制原理的研究提供一定思路。由于每個人對顏色的感知不同，在觀察點的深淺時會略有差異，今后我們會不斷改進條件，或者采用一些先進設備，減少人為出現的誤差。