載姜黃素靶向脂質體對心肌梗死的治療研究

扈丹丹 楊志浩 高亞麗 蔣 蕾 王 娜 劉肖瑩

哈爾濱醫科大學大慶校區藥學院，黑龍江大慶 163319

心肌梗死是冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死[1]。天然產物作為一種有效、副作用小的藥物逐漸被臨床重視，白藜蘆醇、姜黃素等在保護和治療心血管疾病方面起到重要作用[2-3]。姜黃素是姜黃發揮藥理作用重要的活性成分[4-7]，具有抗炎、保護肝臟及抗癌等作用[8-12]。此外，姜黃素具有心肌保護作用[13-15]，但姜黃素水溶性差，生物利用度低，限制了應用[16-17]。脂質體（liposome，LIP）和納米乳劑等納米制劑是促進姜黃素釋放的優良載體制劑[18-20]。抗cTnI 抗體修飾的脂質體具有心肌靶向性[21-22]，本研究旨在探討cT-Cur-LIP 將姜黃素聚集于靶區并發揮治療心肌梗死的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞

實驗動物購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司[許可證：SCXK（吉）2018-0007，合格證：201900031031]，動物室內飼養，已通過哈爾濱醫科大學（大慶）倫理審查；大鼠心肌細胞H9c2 購于中科院上海細胞生物學研究所。H9c2 細胞用10%胎牛血清的DMEM 培養，37℃、5%CO2。

1.2 藥物與試劑

姜黃素（純度＞98%）458-37-7（北京伊諾凱科技有限公司，P1671481）；抗cTnI 抗體（1.0 mg/ml）（北京安諾倫生物科技有限公司，QTS20190103）；蛋黃卵磷脂[艾偉拓（上海）醫藥科技有限公司，AL18001]；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000，DSPE-PEG2000[艾偉拓（上海）醫藥科技有限公司，B50845]。

1.3 儀器

粒度電位分析儀（英國Malvern instruments 公司，Zetasizer Nano S90）；流式細胞儀（美國Beckman Coulter 有限公司，CytoFLEX S）；酶標儀（美國博騰儀器有限公司，SYNERGY/HTX）；DeltaVision 顯微鏡系統（美國GE 有限公司，DeltaVision Ultra）。

1.4 抗cTnI 抗體修姜黃素脂質體（anti-cTnI antibody modified curcumin liposome，cT-Cur-LIP）的制備

1.4.1 LIP 的制備 膽固醇、DSPE-PEG2000、蛋黃卵磷脂、三氯甲烷溶解。避光旋蒸，生理鹽水水化。超聲200 W，10 s，間隔5 s，20 次，220 nm 濾膜過濾，即得。

1.4.2 Cur-LIP 的制備 按照“1.4.1”的方法，成膜時加姜黃素。

1.4.3 抗cTnI 抗體修飾脂質體(anti-cTnIantibody-liposome，cT-LIP)的制備 DSPE-PEG2000-MAL 3.3 mg 溶于1 ml 4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES]緩沖溶液中。50 μl 抗cTnI 抗體溶于1 ml HEPES 緩沖溶液中。將兩者等體積混合，4°C 12 h，得DSPEPEG-MAL-cTnI。透析30 min。將DSPE-PEG2000-MAL-cTnI 與等體積的LIP 37°C 孵育2 h，得cT-LIP。

1.4.4 cT-Cur-LIP 的制備 按照“1.4.3”的方法，將DSPE-PEG2000-MAL-cTnI 與等體積的Cur-LIP 37°C孵育2 h，得cT-Cur-LIP。

1.4.5 cT-Cur-LIP 粒徑和電位的測定 馬爾文激光粒度分析儀測定電位，平均粒徑，重復3 次。

1.4.6 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的包封率測定 姜黃素脂質體破膜后測得的濃度為C1，未處理測得的姜黃素脂質體濃度為C2，重復3 次。包封率（%）=（C1/C2）×100%。

1.4.7 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的釋放率測定 紫外分光光度計檢測24 h 透析外液的吸光度，代入以姜黃素濃度梯度為橫坐標，吸光度作為縱坐標的標準曲線中，計算出該時間點釋放率，重復3 次。

1.4.8 穩定性 將Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 分別取1 ml 至標品瓶中，同時在4℃避光條件下第0、1、7、15天拍照對比，觀察其穩定性。

1.5 細胞增殖-毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK8）檢測法

將細胞接種貼壁后，缺氧培養3 h，分別加入濃度為13、20、27、40、54 μmol/L 的Cur、Cur-LIP 和cTCur-LIP。24 h 后每孔加入10 μl 的CCK-8，2 h 后酶標儀測定450 nm 的吸光度，計算細胞存活率，重復3 次（體外實驗在缺氧條件下，模擬體內心肌缺血生理環境，構建細胞模型）。

1.6 流式細胞術

細胞培養同上后，加入Cur、Cur-LIP 和cT-Cur-LIP，避光2 h。流式細胞儀檢測，重復3 次。

1.7 活細胞工作站

細胞培養同上，用Hoechst 33258（10 g/L）染核和Dio（6 g/L）染膜，5 min，加入Cur-LIP 和cT-Cur-LIP，間隔15 s，30 min，電子顯微鏡成像。

1.8 TTC 染色

SPF 級Wistar 大鼠40 只，雌雄各半，6～8 周齡，體質量180～220 g，將40 只大鼠按照隨機數字表分為假手術組、模型組、Cur-LIP 和cT-Cur-LIP，每組10只。采用結扎冠狀動脈前降支法建立心肌梗死模型，若心電圖可見Ⅱ導聯ST 段呈弓背向上，較術前抬高0.2 mV 以上即可認為造模成功。尾靜脈注射Cur-LIP和cT-Cur-LIP，每2 天1 次，持續2 周。心臟組織切片，2%TCC 染色20 min。觀察變化。

1.9 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法

取離體心臟同上。4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋12 h，干燥3 h。脫蠟，染色，封片，24 h 后熒光成像。

1.10 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對所得數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，采用方差分析。計數資料以例數或百分比表示，采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 cT-Cur-LIP 的表征

2.1.1 特征考察 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 包封率分別是（87.98±1.09）%和（89.94±1.67）%，24 h 釋放率分別是（65.06±0.14）%和（62.68±5.73）%。各粒子粒徑、電位見表1。

表1 各組粒徑及電位（，n=3）

表1 各組粒徑及電位（，n=3）

注 cT-Cur-LIP：抗cTnI 抗體修姜黃素脂質體

2.1.2 cT-Cur-LIP 的表征 cT-Cur-LIP 如圖1 所示，表面形態規整，呈橢圓形。

圖1 cT-Cur-LIP 的電鏡圖

2.1.3 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的穩定性考察 圖2分別為Cur-LIP、cT-Cur-LIP 在4°C 避光條件下放置15 d，在第0、1、7、15 天觀察溶液澄清無沉淀。

圖2 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的穩定性

2.2 細胞存活率

藥物濃度為27 μmol/L 時，cT-Cur-LIP 心肌細胞存活率高于Cur，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 Cur、Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 對H9c2 細胞的毒性（n=3）

2.3 測定藥物的攝取

cT-Cur-LIP 攝取量高于Cur 和Cur-LIP，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖4。

圖4 Cur、Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的攝?。╪=3）

2.4 觀察藥物的攝取

圖5 顯示，cT-Cur-LIP 在心肌細胞中富集，而Cur-LIP 在心肌細胞中聚集較少。

圖5 心肌細胞對Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 攝取

2.5 cT-Cur-LIP 治療心肌梗死大鼠的效果

2.5.1 TTC 染色 假手術組心臟切片全部呈現深色；心肌梗死組基本為白色；Cur-LIP 組大部分呈白色，小部分為深色；cT-Cur-LIP 組大部分呈深色，小部分為白色。見圖6。

圖6 TTC 染色驗證cT-Cur-LIP 對心肌梗死的療效

2.5.2 HE 染色 假手術組心肌組織的形態和細胞核大小一致，纖維排列均勻，胞漿橫紋清晰；模型組胞漿橫紋消失，形成深淺不一的橫帶，核碎裂溶解；Cur-LIP 組胞漿橫紋消失，細胞核固縮；cT-Cur-LIP 組心肌細胞的纖維排列均勻，胞漿橫紋清晰，但局部橫紋消失。見圖7。

圖7 HE 染色驗證cT-Cur-LIP 對心肌梗死的療效

3 討論

本研究結合抗體介導的藥物傳遞系統原理，設計了一種心肌靶向的納米靶向制劑[23]。cTnI 作為心肌梗死的黃金標準標志物，僅在心臟損傷時才會特異性表達[24-25]，將抗cTnI 抗體偶聯的磷脂衍生物嵌入到姜黃素脂質體，即得到cT-Cur-LIP。體內結果顯示，cTCur-LIP 可以有效地靶向缺血心肌，明顯提高心肌梗死大鼠的治療效果，但是姜黃素對于心肌梗死的治療機制仍需進一步探究[26]。