LR12 肽通過調控TLR-4/ NF-κB 信號通路對壞死性小腸結腸炎新生小鼠腸道損傷的影響

占彩霞 廖鎮宇 黃瑞文 劉銀芝 楊 慧

湖南省兒童醫院新生兒科，湖南長沙 410007

壞死性小腸結腸炎（necrotic enterocolitis，NEC）是以腸道炎癥為特點的消化系統疾病，常發生于早產兒，由于復雜的發病因素，臨床上缺乏有效治療手段，死亡率約為30%[1]。NEC 病情進展較快，目前尚未完全闡明其發病機制，但認為腸黏膜屏障結構和功能的改變及腸道炎性損傷是其發病基礎[2]。髓細胞觸發受體1（triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1）是一種炎癥激發受體，能通過激活TLR-4/NF-κB 信號通路放大炎癥級聯反應，其在膿毒癥、結腸炎等炎癥疾病中發揮重要作用[3-5]。作為一種TREM1特異性抑制肽，LR12 肽能夠捕獲TREM1 配體，阻斷TREM1 介導的炎癥反應，具有顯著的抗炎作用[6]，目前已被美國食品藥品監督管理局批準為治療膿毒性休克的藥物。但目前還未知曉LR12 肽對NEC 是否有治療效果，為此，本研究通過構建幼鼠NEC 模型，并進行LR12 肽干預，探討LR12 肽對NEC 的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 小鼠18 只（雌性6 只，雄性12 只），8 周齡，體重16～23 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（川）2019-031，動物合格證號：No.1103241911007575。實驗遵循國家實驗動物倫理規范。

1.2 主要試劑

LR12 肽（LQEEDTGEYGCV）及其無效肽LR12 scramble（YQMGELCAGEED）由北京賽百盛基因技術有限公司合成并提供；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，貨號：SMB00704）、異硫氰酸熒光素-葡聚糖（FITCDextran，貨號：46944）購自美國Sigma-Aldrich 公司；鼠白細胞介素（interleukin，IL）-1β（貨號：CSB-E08054m）、IL-6（貨號：CSB-E04639m）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，貨號：CSB-E04741m）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自武漢華美生物有限公司；TREM1（11791-1-AP）購自武漢三鷹生物技術有限公司；TLR-4（貨號：14358S）、MyD88（貨號：4283S）、NF-κB p65（貨號：6956S）、IκBα（貨號：4814S）、GAPDH（貨號：51332S）抗體購自美國CST 公司；ECL 顯影試劑盒購自美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模及給藥 將雌鼠和雄鼠按照1∶2 合籠受孕，孕鼠共計產仔60 只。采用隨機數字表法將幼鼠分為四組（n=15）：對照組、模型組、LR12-scr 組（作為陰性對照）和LR12 組。將2 日齡幼鼠置于保育箱，喂養方式采用人工喂養，代乳品及喂養劑量參考文獻[7]配制。對照組不做任何操作，其余三組采用缺氧冷刺激+LPS 干預法[8]構建NEC 模型：將幼鼠放入90%氮氣中缺氧90 s，然后置于4℃冰箱進行冷刺激10 min，再腹腔注射7 mg/kg LPS，連續操作3 d。造模結束后，若幼鼠NEC 臨床癥狀評分≥8 分視為模型成功[9]。模型成功且無死亡。LR12-scr 組腹腔注射5 mg/kg LR12 scramble，LR12 組腹腔注射等劑量LR12 肽，對照組和模型組給予等量溶劑，1 次/d，連續3 d。

1.3.2 幼鼠臨床癥狀評分 記錄所有幼鼠實驗前后的體重，并于實驗結束時參考文獻[10]進行臨床癥狀評分。見表1。

表1 NEC 臨床癥狀評分標準

1.3.3 檢測腸黏膜通透性 所有幼鼠灌胃40 mg/g 的FTTC-Dextran 溶液，4 h 后眼眶取血，3500 r/min 離心10 min，離心半徑為15 cm。采用酶標儀測定血漿熒光強度，制作標準曲線并計算其濃度。

1.3.4 蘇木精-伊紅（hematoxylineosin,HE）染色所有幼鼠取回盲部腸組織固定24 h 后取出，石蠟包埋后切片5 μm，行HE 染色。參考Nadler 標準[9]進行雙盲評分，評分≥3 分者視為NEC 樣腸損傷。見表2。

表2 Nadler 評分標準

1.3.5 檢測腸組織中炎癥因子水平 取所有幼鼠腸組織制備組織勻漿，在4℃，3000 r/min 離心15 min，離心半徑為15 cm，取上清，按照試劑盒說明書的步驟檢測TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達水平。

1.3.6 檢測相關蛋白表達 取所有幼鼠腸組織裂解成組織勻漿，12 000 r/min 離心20 min，離心半徑為15 cm，取上清，按照BCA 法進行蛋白定量。取25 μg 蛋白，經SDS 凝膠電泳，轉膜，加入TREM（1∶1000）、TLR-4（1∶1000）、MyD88（1∶1000）、NF-κB p65（1∶500）、IκBα（1∶500）和GAPDH（1∶1000）孵育，TBST 清洗，加入相應屬性二抗（1∶10 000），膜滴加ECL 試劑后，采用全自動化學發光分析儀進行顯影。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組幼鼠實驗前后體重變化、臨床癥狀積分比較

各組實驗前體重比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），實驗后模型組體重低于對照組，而LR12 組體重高于模型組，差異均有統計學意義（P ＜0.05）；模型組臨床癥狀積分高于對照組，LR12 組積分低于模型組，差異均有統計學意義（P ＜0.05），而LR12-scr 組積分與模型組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表3。

表3 各組幼鼠實驗前后體重變化、臨床癥狀積分比較（）

表3 各組幼鼠實驗前后體重變化、臨床癥狀積分比較（）

注 與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05

2.2 各組幼鼠腸組織病理學及腸黏膜通透性比較

對照組腸組織病理結構正常。模型組和LR12-scr 組腸組織絨毛雜亂，部分絨毛脫落甚至缺失，肌層變薄。LR12 組腸組織結構較清晰，絨毛壞死或脫落現象減少。見圖1。模型組腸組織病理學評分和血清FITC-Dextran 含量高于對照組，LR12 組病理評分和血清FITC-Dextran 含量低于模型組，差異均有統計學意義（P ＜0.05），而LR12-scr 組以上數據與模型組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表4。

表4 各組幼鼠腸組織病理學評分及血清FITC-Dextran 含量比較（）

表4 各組幼鼠腸組織病理學評分及血清FITC-Dextran 含量比較（）

注 與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05

圖1 HE 染色觀察腸組織病理學變化

2.3 各組幼鼠腸組織炎癥因子水平比較

模型組TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平高于對照組，LR12 組TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平低于模型組，差異均有統計學意義（P ＜0.05），而LR12-scr 組以上指標與模型組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表5。

表5 各組幼鼠腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平比較（ng/L，）

表5 各組幼鼠腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平比較（ng/L，）

注 與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細胞介素-6

2.4 各組幼鼠腸組織中TREM1 蛋白及TLR-4/NF-κB信號通路相關蛋白表達變化

與對照組比較，模型組腸組織中TREM1、TLR-4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白水平升高，IκBα 蛋白水平降低，差異有統計學意義（P ＜0.05）；與模型組比較，LR12 組TREM1、TLR-4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白水平降低，IκBα 蛋白水平增加，差異有統計學意義（P ＜0.05）；而LR12-scr 組以上指標與模型組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖2。

圖2 各組幼鼠腸組織中相關蛋白表達水平（n=15）

3 討論

LPS+低氧刺激是反應人類NEC 最成功的建模方法[11]。本研究結果顯示，模型組幼鼠表現出明顯的NEC癥狀，并出現嚴重的腸損傷、腸黏膜屏障受損，炎癥加重等變化，說明NEC 模型成功。然而，本研究采用LR12 肽干預后，幼鼠NEC 癥狀有所緩解，腸道損傷減輕，腸黏膜通透性改善，炎癥水平降低，并且顯著抑制TREM1 表達和TLR-4/NF-κB 信號通路的活化。提示，LR12 肽對NEC 具有改善作用。

TREM1 是一種新型炎癥激發受體，其可激活并放大TLR-4/NF-κB 信號通路，促進促炎因子的釋放[12-14]。Shen 等[15]研究顯示，潰瘍性結腸炎疾病的嚴重程度和活動度與TREM1 顯著相關。相關研究[16-17]報道，下調TREM1 表達可抑制小鼠結腸炎炎癥反應及相關腫瘤的發生。作為TREM1 特異性抑制肽，LR12 肽常應用于TREM1 介導的炎癥反應的相關研究中，并已成為一種治療膿毒癥休克的臨床用藥[18]。然而，LR12 肽對NEC 的影響尚不清楚。本研究結果顯示，采用LR12肽干預后，NEC 幼鼠臨床癥狀有所改善，并且腸組織損傷減輕，腸黏膜通透性及腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平均降低，提示LR12 肽對NEC 具有一定的改善作用。本研究進一步顯示，NEC 幼鼠腸組織中TREM1蛋白表達水平顯著增加，而LR12 肽干預可抑制NEC幼鼠腸組織中TREM1 蛋白表達，提示LR12 肽對NEC的改善作用可能與抑制TREM1 表達有關。

TLR-4/NF-κB 信號通路是調控炎癥反應的主要通路之一，且TREM1 介導的炎癥反應均由該信號通路發揮作用。TLR-4 激活后會通過MyD88 觸發信號，降解IκBα 和釋放NF-κB p65，從而激活NF-κB[19-20]。而NF-κB 作為核轉錄因子，可誘導TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達[21]。腸道免疫系統異常激活導致的炎癥“瀑布”效應是NEC 發病的關鍵因素[22-23]。眾多研究[24-25]顯示，抑制TLR-4/NF-κB 信號通路活化可改善NEC 腸損傷，降低炎癥反應。Shi 等[26]研究顯示，LR12肽通過降低TREM 1 的表達，抑制NF-κB 信號通路的激活來緩解LPS 誘導的急性肺損傷。本研究結果顯示，NEC 幼鼠腸組織中TLR-4/NF-κB 炎癥信號通路異常活化。采用LR12 肽干預后，NEC 幼鼠腸組織中TLR-4/NF-κB 炎癥信號通路受到抑制。因此，LR12肽可能通過下調TREM1，進而抑制TLR-4/NF-κB 炎癥信號通路活化，最終降低炎癥反應及腸黏膜通透性，改善NEC 腸道損傷。

綜上所述，LR12 肽能夠改善腸黏膜通透性，抑制腸組織炎癥反應，從而減輕腸組織損傷，其機制可能與抑制TLR-4/NF-κB 信號通路活化有關，本研究可為NEC 疾病的預治療提供了新的方向。