miR-195 調控人乳腺癌細胞MCF-7 增殖與凋亡的作用及機制研究

劉嘉祺 翟鳳國 高金霞 劉佳維 楊旭東 周福波 李孟全

1.牡丹江醫學院藥理教研室，黑龍江牡丹江 157011；2.牡丹江醫學院預防醫學教研室，黑龍江牡丹江 157011；3.牡丹江醫學院有機化學教研室，黑龍江牡丹江 157011；4.牡丹江醫學院醫藥研究中心，黑龍江牡丹江 157011

乳腺癌是導致患者死亡的常見婦科惡性腫瘤[1-2]，其發病機制尚不十分清楚。蛋白磷酸酶1D（protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta，PPM1D）為一種癌基因，在乳腺癌細胞中高表達，發揮重要作用[3-5]。miR-195 為非編碼RNA 分子[6-7]，調控癌癥發生發展過程[8-10]。而miR-195 在乳腺癌發病機制中扮演著什么樣的角色？miR-195 與靶基因的調控作用怎樣?目前相關報道尚少。本實驗觀察人乳腺癌細胞miR-195 和PPM1D 表達，探討miR-195 對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制，旨在為乳腺癌的發生機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM 高糖培養基（貨號：11995）；胎牛血清（貨號：SV30087）；胰蛋白酶消化液（貨號：C0201）；蛋白酶抑制劑（貨號：P1005）；細胞裂解液（貨號：P0013）；中國上海碧云天生物公司；SYBR qPCR Mix，RtqPCR Kit（貨號：FSQ-101）；日本東洋紡（上海）生物科技有限公司；X-treme GENE siRNA（貨號：04476093 001），瑞士羅氏公司；DAPI 染色液（貨號：E-IR-R103），中國武漢博士德生物工程有限公司；TUNEL 試劑盒（貨號：11684817910），瑞士羅氏公司。

1.2 細胞培養

正常乳腺上皮細胞MCF-10A 和人乳腺癌細胞MCF-7 復蘇，細胞沉淀中加入細胞培養液，轉移至培養瓶，37℃，5% CO2孵箱培養。待細胞生長至70%～80%，適量胰蛋白酶消化細胞，補足培養液，繼續培養。

1.3 MCF-7 轉染

MCF-7 瞬時轉染，實驗MCF-7 組；miR-195 mimics組（MCF-7 轉染miR-195 擬似物）；miR-195 inhabitor組（MCF-7 轉染miR-195 抑制劑）；陰性對照NC 組（MCF-7 轉染無關陰性對照序列negative control，NC）。轉染過程避光進行，36 h 后進行后續實驗。

1.4 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法檢測細胞增殖

將各實驗組細胞接種于96 孔板中，各實驗組設5 個復孔。MTT 溶液（20 μl/孔）培養箱中孵育4 h。隨后加150 μl 二甲基亞砜，室溫搖床振蕩10 min。490 nm 波長下檢測各孔吸光度值。

1.5 DNA 斷裂的原位末端標記法（TdT-mediatedduTP nick end labeling，TUNEL）法檢測細胞凋亡

培養細胞，將滅菌后的玻片鋪于24 孔板中，每孔加入500 μl 細胞懸液。孵育48 h 后處理細胞，參照TUNEL 檢測試劑盒檢測細胞凋亡。

1.6 蛋白質免疫印跡（Western blot，WB）檢測蛋白表達

轉染的細胞用刮刀刮下，2500 r/min，4℃離心10 min。棄上清，每份樣品加入RIPA 和蛋白酶抑制劑，冰上超聲破碎。經10%丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉，室溫搖床2～3 h，孵育一抗PPM1D 和β-actin，4℃孵育過夜。洗膜，室溫孵育熒光二抗，再洗膜。總蛋白以β-actin 作內參，紅外熒光掃描系統檢測，odyssey 軟件進行光密度積分值分析。

1.7 qRT-PCR 法檢測miR-195 表達

qRT-PCR 包括總RNA 提取，逆轉錄和實時熒光定量PCR 三部分。逆轉錄反應體系：5×RT buffer 2 μl，RT Enzyme mix 0.5 μl，Primer mix 0.5 μl，Random 引物1 μl，總RNA 0.5 μg，Nuclease-Free Water 將反應體系補至10 μl。PCR反應體系：SYBR 混合體系10 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，cDNA 1 μl，Nuclease-Free Water 7 μl 補足至20 μl。PCR 擴增條件：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，U6 為內參，ABI Prism?7500 fast 儀器設置40 個循環。miR-195-5p 正向引物5’-GCGCGTAGCAGCACAGAAA-3’，反向引物5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；U6 正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.8 熒光素酶報告基因驗證靶向調控作用

將HEK293 細胞接種于96 孔板，24 h 后轉染miR-195 mimics 或陰性對照NC 及含miR-195 結合PPM1D 3’UTR 序列或突變序列的質粒，48 h 后通過雙熒光素酶報告基因檢測系統測定熒光素酶活性。

1.9 統計學方法

應用GraphPad Prism 6.0 軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同細胞系miR-195 表達

qRT-PCR 結果，MCF-7 組miR-195 表達低于MCF-10A 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖1。

2.2 不同細胞系PPM1D 表達

WB 結果，MCF-7 組PPM1D 蛋白表達高于MCF-10A 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖2。

2.3 miR-195 對人乳腺癌MCF-7 細胞增殖和凋亡影響

MTT 結果，miR-195 mimics 組細胞活力明顯低于MCF-7 組，miR-195 inhabitor 組細胞活力高于MCF-7 組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見圖3。TUNEL 結果，miR-195 mimics 組細胞凋亡率明顯高于MCF-7 組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；miR-195 inhabitor 組細胞凋亡率低于MCF-7 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖4～5。

圖4 TUNEL 染色圖像顯示綠色為凋亡細胞，為DAPI 染色細胞核（40×）（n=3）

圖5 TUNEL 結果（n=3）

2.4 miR-195 對PPM1D 調控作用

通過TargetScan 等miRNA 靶基因預測網站，預測miR-195 可能調控的靶基因。Has-miR-195-5p 的5’端有能夠與PPM1D mRNA 3’非翻譯區（untranslated area，UTR）互補區域，提示miR-195 可能在轉錄后水平靶向調控PPM1D 基因表達。見圖6。

圖6 預測miR-195 與PPM1D 3’UTR 之間結合位點

攜帶含有PPM1D 基因片段miR-195 mimics 組熒光素酶的活性低于MCF-7 組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；攜帶含有突變PPM1D 基因片段miR-195 mimics 組與MCF-7 組熒光素酶活性比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖7。

圖7 miR-195 對PPM1D mRNA 3’UTR 調控作用（n=3）

3 討論

微RNA 與多種癌癥發病機制密切相關[11-13]，其中miR-195 在癌細胞中表達異常[14-19]，扮演著關鍵角色。PPM1D 為絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，是一種重要的腫瘤蛋白[20-23]，對許多重要的腫瘤抑制途徑具有負調控作用[24-25]。在本實驗中，MCF-7 組miR-195 表達低于MCF-10A 組，而PPM1D 蛋白表達高于MCF-10A 組。MCF-7 轉染miR-195 mimics 后，細胞活力明顯降低，細胞凋亡率顯著增高；轉染miR-195 inhabitor 后，細胞活力明顯增高，細胞凋亡率降低。提示miR-195 對細胞的增殖和凋亡有一定程度影響。本文進一步探究miR-195 對人乳腺癌細胞增殖和凋亡作用機制。通過查詢，PPM1D mRNA 的3’端有miR-195 可結合的序列。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，PPM1D 是miR-195 直接作用的靶點。

綜上，MCF-7 中miR-195 與PPM1D 呈負相關，miR-195 可能通過直接靶向PPM1D mRNA 的3’-UTR，調控乳腺癌細胞的增殖與凋亡，這也是其調控機制的一部分，對于乳腺癌發病過程中所涉及miR-195正向作用或PPM1D 反向作用機制，還有待于進一步研究。