雄激素對良性前列腺增生患者基質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

任 超 易發(fā)現(xiàn) 黃 勇 朱小軍 李建宏

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是中老年男性發(fā)病率最高的慢性疾病之一，通常伴有組織學(xué)炎癥，使前列腺結(jié)構(gòu)變化和癥狀發(fā)生[1]。無臨床表現(xiàn)的組織學(xué)慢性炎癥使前列腺組織不斷破壞和再生，造成前列腺結(jié)節(jié)增生性增大，同時引起前列腺基質(zhì)重塑，可增加排尿阻力，致病情由無癥狀BPH 變?yōu)橛邪Y狀BPH[2]。臨床上常表現(xiàn)為尿頻、尿急、尿無力等。這種炎癥不但導(dǎo)致下尿路癥狀（lower urinary tract symptoms，LUTs），還可升高前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）[3-4]。本研究擬通過體外培養(yǎng)人前列腺原代間質(zhì)細(xì)胞，通過腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）刺激，檢測基質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)情況，再加入雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT），再檢測炎癥反應(yīng)，探索雙氫睪酮對前列腺間質(zhì)細(xì)胞的炎癥影響作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016 年1 月至2017 年5 月就診于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科20 例行經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)（transurethral resection prostate，TURP）患者資料。患者平均年齡（65.2±8.2）歲。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，注冊號為2017（008）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：因前列腺增生擬行TURP 術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：前列腺惡性腫瘤、膀胱惡性腫瘤及泌尿系感染；前列腺組織經(jīng)病理診斷伴有炎癥；術(shù)前3 個月有抑雄或抗炎等藥物治療[5-6]。

1.2 組織塊法體外培養(yǎng)人前列腺基質(zhì)細(xì)胞

取行TURP 患者移行區(qū)組織，剪碎至1 mm3，以間距5 mm 進(jìn)行接種。細(xì)胞培養(yǎng)液采用高糖DMEM（Hyclone，USA）+10%FBS（Gibco，USA）+1%鏈霉素完全培養(yǎng)基[5,7]。

1.3 觀察指標(biāo)

相差顯微鏡（Olympus，Japan）觀察細(xì)胞生長狀況和形態(tài)。第3 代前列腺基質(zhì)細(xì)胞通過免疫組織細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行鑒定。傳代后生長占80%～90%時進(jìn)行染色[7]。

1.4 實驗分組、留取上清液

將第3 代前列腺間質(zhì)細(xì)胞分別傳代于75 mm 培養(yǎng)皿，依次命名為空白組、對照組、實驗組，加入相同濃度、劑量的培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d 后，空白組行細(xì)胞換液，對照組和實驗組分別加入TNF-α（Peprotech，USA）10 ng/ml，5 h 后在實驗組加入DHT（MCE，USA）30 nmol/L，再共同培養(yǎng)24 h 后分別取三個組的上清液各100 μl，每組4 個復(fù)孔[8]。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測各細(xì)胞因子濃度水平

提前取出試劑盒（欣博盛，深圳，Lot.H3071-6C），平衡至室溫；空白孔加入通用稀釋液，其他孔中加入各組所取上清液（100 μl/孔）；經(jīng)5 次洗板，空白孔加入抗體稀釋液，其余孔加工作液；再經(jīng)酶結(jié)合物稀釋液和5 次洗板后加入顯色底物、終止液，即刻分別測量三組白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）細(xì)胞因子濃度水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡觀察前列腺基質(zhì)細(xì)胞

培養(yǎng)5～6 d 后組織塊邊緣可觀察到少量細(xì)胞開始爬出，第1 代細(xì)胞大多為形態(tài)多樣的上皮細(xì)胞和長纖維狀的基質(zhì)細(xì)胞；第2 代細(xì)胞經(jīng)胰酶等作用大部分為前列腺基質(zhì)細(xì)胞；第3 代細(xì)胞為梭形或長纖維狀的間質(zhì)細(xì)胞。

2.2 免疫組織化學(xué)法鑒定細(xì)胞

波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白有棕黃色顆粒沉淀著色；角蛋白、結(jié)蛋白未見棕黃色顆粒沉淀著色。見圖1。

圖1 免疫組化法鑒定的第3 代前列腺間質(zhì)細(xì)胞（200×）

2.3 三組細(xì)胞因子的濃度比較

對照組IL-6、IL-8、MCP-1、bFGF 濃度高于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。實驗組IL-6、IL-8、MCP-1、bFGF 濃度低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 三組IL-6、IL-8、MCP-1、bFGF 濃度比較（）

表1 三組IL-6、IL-8、MCP-1、bFGF 濃度比較（）

注 與空白組比較，aP ＜0.05；與對照組比較，bP ＜0.05。IL：白細(xì)胞介素；MCP-1：單核細(xì)胞趨化蛋白-1；bFGF：堿性成纖維細(xì)胞生長因子

3 討論

中老年男性良性BPH 患者多數(shù)同時合并有組織學(xué)炎癥，造成潛在隱患。Zlotta 等[9]尸檢發(fā)現(xiàn)，超過70%前列腺組織中存在慢性炎癥。前列腺組織學(xué)炎癥不僅促進(jìn)前列腺炎癥的發(fā)展，導(dǎo)致LUTs 的發(fā)生、PSA 的升高[10]，還促使BPH 發(fā)展為前列腺癌[11]。因而，雄激素對前列腺組織學(xué)炎癥的早期干預(yù)治療，不僅可減少或緩解下尿路癥狀，而且對減少前列腺癌的發(fā)生具有重要意義。

研究顯示，炎癥增加與睪酮缺乏有關(guān)[12]。高脂飲食引起的睪酮缺乏導(dǎo)致前列腺炎癥，可以通過補充睪酮來逆轉(zhuǎn)[13]。158 例接受TURP 治療的BPH 患者雄激素水平與LUTs 的關(guān)系研究顯示，總IPSS 與總睪酮水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.21，P=0.01），雄激素的補充可緩解LUTs 癥狀[14-15]。為了探究DHT 是否具有抗炎作用，本研究通過體外培養(yǎng)人前列腺間質(zhì)原代細(xì)胞，使用DHT 激活雄激素受體（androgen receptor，AR）的試驗，結(jié)果顯示：實驗組的炎癥不同程度下降，提示雄激素直接發(fā)揮抗炎作用，這種抗炎作用也降低了相關(guān)炎性細(xì)胞因子濃度水平，在細(xì)胞因子層面表面其抗炎作用。所以在維持前列腺內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中DHT 和基質(zhì)細(xì)胞AR 受體有著重要作用[16-18]。這與小鼠敲除AR 受體基因，造成前列腺增生和組織學(xué)炎癥的研究相一致[19-20]。

前列腺內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)受恒定濃度的促炎細(xì)胞因子調(diào)控，濃度升高則造成炎癥[21]。而恰恰在本研究中的細(xì)胞因子層面證實：雄激素使促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8、MCP-1、bFGF 濃度水平不同程度下降。Saad 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，遲發(fā)型性腺功能減退患者較無遲發(fā)型性腺功能減退的前列腺炎癥狀重，這可能與雄激素缺乏有關(guān)。另有研究顯示，DHT 替代治療戒斷后，間質(zhì)細(xì)胞中促炎因子濃度升高，補充雄激素后其濃度水平則又下降[23-24]。

本研究證實雄激素能抑制老年男性BPH 患者前列腺基質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。需進(jìn)一步的研究來探索DHT 抑制基質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的準(zhǔn)確機制，以便更好地臨床治療。