生發中心B細胞應答異常引起的自身免疫性疾病研究進展

陳雅雯，蔡少麗

（福建師范大學南方生物醫學研究中心 福建省天然免疫生物學重點實驗室，福建 福州 350117）

生發中心（germinal center，GC）是抗原（antigen，Ag）激活的B細胞進行克隆擴增、免疫球蛋白基因超突變和親和力選擇的主要位點，是在T細胞依賴性抗體應答過程中于外周淋巴組織內形成的一個促使B淋巴細胞產生特異性抗體的特殊結構。GC主要由B細胞組成，其中也有部分抗原特異性T細胞，為B細胞分化提供輔助。GC B細胞的選擇包括： B 細胞進一步克隆擴增、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）基因可變區的體細胞高頻突變（somatic hypermutation，SHM)、高親和力B細胞克隆的陽性選擇以及無關或自身反應性B細胞克隆的陰性選擇[1]，Ig類型轉換以及分化為可分泌特異性抗體的記憶B細胞和漿細胞，從而參與體液免疫的過程。這些選擇受轉錄因子、表觀遺傳修飾因子和信號通路的復雜網絡調控，且信號通路與GC B細胞轉運機制起協同作用[2]。調節B淋巴細胞成熟和穩定的基本機制——凋亡在生發中心B細胞的生長分化中極為重要，當凋亡調控系統出現異常，存活下來的自身反應性B細胞會產生無法被自然清除的自身反應性抗體，進而與自身抗原反應引起自身免疫性疾病，進一步導致免疫系統的異常。

1 生發中心B細胞的應答過程

在外周淋巴組織的T細胞區，抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC)/并指狀細胞（interdigitating dendritic cell，IDC）將攝取的抗原（antigen，Ag）加工后，通過主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子將Ag提呈給T細胞，通過CD80-CD28膜分子將共刺激信號傳導給T細胞使其活化。活化T細胞成功識別B細胞受體（B-cell receptor，BCR）提呈的加工后Ag，通過CD40-CD40L傳導B細胞活化信號。活化后的B細胞能與活化T細胞一起進入初級淋巴濾泡中起始生發中心反應[3]，也能在濾泡間區繼續增殖進而終末分化為產生IgM和IgG兩種較低親和力抗體（antibodys，Abs）的短期漿細胞。

進入初級淋巴濾泡中的再循環B細胞在大量濾泡樹突狀細胞形成的網絡系統中穿行，在生發中心的暗區（dark zone，DZ）迅速增殖，分化為中心母細胞（centroblasts，CBs）并發生IgV區基因體細胞高頻突變（SHM）[4]，在FDC提供的生長因子作用下，凋亡受抑制。隨著時間的推移，形成數量巨大、具有不同親和力BCR的B細胞克隆，即中央細胞（centrocytes，CCs)，它們向GC的亮區（light zone，LZ）遷移，先后與在親和力選擇過程中介導關鍵作用[5]的FDC和T濾泡輔助細胞（T follicular helper，Tfh)[6]進行Ag識別和結合，完成親和力成熟和Ig同類型轉換。接收Tfh信號的表達高親和力Abs CCs能進一步增殖分化為長壽命存儲單元記憶B細胞和抗體分泌型漿細胞[7]，也能回到DZ啟動新一輪的GC應答[8]（圖1）。

圖1 生發中心B細胞的應答過程

經過SHM，CCs會形成高親和力、低親和力以及自身反應性突變株。高親和力B細胞與FDC結合后能免于被溶酶體破裂而發生凋亡，其余B細胞因無法與FDC作用而發生凋亡，繼而被可染體巨噬細胞（tingible body macrophages，TBMs）清除[9]。GC獨特的生理功能就是使功能性B細胞存活，使無關或自身反應性B細胞凋亡，以維持B淋巴細胞的動態穩定，防止因自身反應性B細胞的存活而引起自身免疫性疾病的情況發生。

2 靶向異常的應答治療自身免疫性疾病

自身免疫性疾病（autoimmune Disease，AID）反映了免疫耐受的崩潰[10]。正常情況下的免疫反應對自身組織不產生攻擊反應[11]，但是如果自身抗體過量產生或異常就有可能會對機體產生傷害，導致自身免疫性疾病的發生。

生發中心B細胞的應答會產生數量多、特異性強的各種B細胞克隆，該過程能起到維持B細胞動態穩定的作用。當GC B細胞應答異常時，可能會使自身反應性B細胞免于凋亡而存活，進而產生自身抗體，引起自身免疫性疾病。Fas-FasL和CD40-CD40L參與調控GC B細胞凋亡的過程，在維持GC穩態、防止自身反應性B細胞的存活上起重要作用。探究靶向Fas-FasL和CD40-CD40L調控過程異常的方法，對防止GC B細胞應答異常以及預防和治療因其引起的包括關節炎在內的自身免疫性疾病具有參考價值。

2.1 Fas/FasL 在關節炎癥中的治療潛力

Fas(CD95 ）是含有死亡結構域的腫瘤壞死因子受體超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF）中的一員，能生理性調控凋亡及在免疫系統疾病和淋巴瘤中起重要作用[12]。FasL（CD95L）是生發中心中T細胞分泌的細胞因子之一，同屬于腫瘤壞死因子超家族，T細胞可通過它誘導GC B細胞發生凋亡。Fas-FasL系統是外源性凋亡途徑的觸發因素[13]，該系統異常將會導致正常的凋亡受抑制[14]。Fas和FasL結合后激活死亡受體，死亡受體和FasL相關死亡結構域（Fas-associated death domain，FADD）互相作用后能募集連接體蛋白，隨后連接體蛋白上的死亡效應結構域與凋亡起始酶procaspase-8上的死亡結構域結合，從而形成能使蛋白酶水解并把procaspase-8活化為caspase-8的死亡誘導信號復合物（death inducing signalling complex，DISC)，觸發下游效應的caspase-3活化來誘導凋亡發生。

生發中心B細胞在隨機性的體細胞高頻突變后不可避免地會產生自身反應性B細胞，若這些細胞逃脫耐受機制，將會形成自身反應性漿細胞和記憶細胞，產生自身反應性抗體，導致自身免疫性疾病的發生。研究發現，Fas缺陷型小鼠身患自身免疫性綜合征是因其不能清除自身反應性B細胞，由此可得，Fas/FasL基因缺陷，可能會導致GC B細胞的陰性選擇發生異常。另一研究[15]表明，去除自身反應性GC B細胞不是必須要依靠Fas的表達，但Fas的表達是防止非抗原依賴性的自身反應性B細胞發展和持續存在，繼而分化為漿細胞導致免疫系統出現異常，是引起自身免疫性疾病發生的必要條件。Fas-Fas 配體（FasL）途徑在維持對自身抗原的免疫耐受中起關鍵作用。可溶性FasL（sFasL）是膜結合F a s L（m F a s L）被基質金屬蛋白酶（m a t r i x metalloproteinase，MMP）水解切割產生的，mFasL對于觸發Fas誘導的凋亡至關重要[16]，而sFasL調節非凋亡過程，但以劑量依賴性方式刺激類風濕性關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）患者成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synovial cells，FLSCs）中的凋亡[17]。有研究[18]表明，腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF）10B（死亡受體DR5）是促進炎癥的mFasL和sFasL非Fas依賴性膜結合受體，FasL-DR5和Fas-FasL相互作用誘導細胞凋亡和壞死，而sFasL-DR5相互作用可能依賴于NF-κB信號通路，通過CX3X1-CX3CR1增加關節炎癥。但當施用FasL或CX3CR1的抗體阻斷其作用，則減弱了小鼠自身抗體誘發的關節炎（autoantibody-induced arthritis,AIA），說明sFasL-DR5相互作用和CX3CL1-CX3CR1可能是控制炎癥的治療靶點。加之sTRAIL可競爭性結合DR5，且sFasL-DR5和sTRAIL-DR5相互作用可誘導FLSCs凋亡，研究DR5與FasL、sFasL、sTRAIL的結合作用大小及先后順序和具體的作用機制，弄清其作用時期是在FLSCs的誘導期還是效應期能更好地確定治療靶點，研發靶向藥物，可能可以規避以往使用的非甾體類控制炎癥藥物具有的引起臟器功能損壞的風險[19,20]。

目前市面上沒有治療RA的特效藥，吳寧的研究[21]證實天然重要苗藥“四大血”（SX）中的活性成分能有效結合包括Fas和FasL在內的調控凋亡的分子，能在毒副作用小的前提下較好地起到抑制FLSCs增生、緩解關節炎癥的作用，但其作用的具體機制仍不清楚，因此還未應用于臨床。

通過Fas-FasL途徑研究分子抑制劑來控制炎癥的發展以達到延緩和治療自身免疫性疾病的效果，然而進一步研究該途徑的作用機制會發現在調控非抗原依賴性自身反應性B細胞凋亡上，Fas的表達才是更為主要的。這些B細胞不僅能逃脫免疫耐受存活下來，還能直接分化為漿細胞，產生自身抗體（多為IgG）引起自身免疫性疾病。不僅如此，在發展后期，IgG抗體可轉變為IgE抗體，可能還會引起過敏性疾病，促進系統系紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）的發展。

深入探究Fas在防止非抗原依賴性自身反應性B細胞存活和增殖的表達機制，是否與在某些情況下能抑制GC反應的T濾泡調節細胞相關，控制施加Fas或作用機理相同的分子激活劑來確定治療靶點，在治療關節炎癥等自身免疫性疾病及預防過敏性疾病的發生中具有一定的參考價值。

2.2 靶向阻斷CD40/CD40L防止炎癥發生

生發中心要具有功能性，必須得在生發中心T細胞的協助下才能產生IgM、IgG、IgA和IgE抗體，同樣為T細胞分泌細胞因子之一的CD40L[22]可參與調控抗體產生種類的過程。與Fas-FasL在GC的作用相反，CD40L是阻止B細胞凋亡的分子，其依賴生發中心T細胞來識別濾泡樹突狀細胞呈遞的抗原，通過CD40配體[23]來激發CD40分子，使B細胞得以繼續存活[24,25]。CD40信號分子可通過轉錄因子NF-κB介導表達靶基因FADD樣白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）轉化酶抑制蛋白（Fas-associated death domain like interleukin-1 betaconvert ingenzyma inhibitory protein，FLIP）來維持FLIP的穩態，抑制caspase-8激活，使DISC失活，即下調Fas作用以使B細胞與FDC的結合作用增強來起到抗凋亡的作用[26]。CD40-CD40L通路是免疫系統細胞之間通訊的支柱[27]，CD40的表達是GC形成和功能所必需的[28]，在生發中心B細胞分化的早期階段，若沒有CD40L的刺激，GC B細胞將會自發凋亡[29]。膜分子CD40與CD40L的結合能促進陽性選擇抗原特異性B細胞，也能起到穩定溶酶體的作用，防止溶酶體酶對GC B細胞的破壞。

以前對于K/BxN小鼠的研究表明，關節炎的發展取決于B細胞CD40的表達。在對治療自發性關節炎小鼠實驗的研究[30]發現，在關節炎發病前進行抗CD40L抗體治療，能明顯降低關節炎的發展，表明抗CD40L抗體可以預防或延遲關節炎的發展。這因為關節炎是由特異性靶標GPI(glucose-6-phosphate isomerase）的抗體引起的，所以可以通過阻斷CD40信號來防止致病性抗葡萄糖-6-磷酸異構酶（GPI）抗體的形成，但抗CD40L抗體并不能治療已經形成的關節炎。抗CD40L的單抗能與抗體IgM共同刺激使B細胞大量擴增，CD40L阻斷可能通過促進其外周缺失阻止了新的自身反應性B細胞的出現[31]，所以該治療方式只適用于延緩炎癥及病情發展。通過抑制自身抗體新形成，或通過與有效的抗炎劑聯合使用，可對關節炎疾病產生長期抑制作用。此研究實驗的小鼠疾病模型類似于人類的類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA)，對RA的預防與阻斷炎癥進程的治療具有參考價值。

CD40-CD40L 是B細胞活化的關鍵共刺激途徑，是一個有吸引力的免疫治療靶點[47]，其阻斷可抑制自身免疫性疾病中的致病性B細胞反應。研究[32]表明KPL-404（一種人源化的IgG4抗CD40單克隆抗體）能靶向結合CD40，達到抑制干燥綜合征（sjogren's syndrome，SjS）和系統性紅斑狼瘡（SLE）中B細胞反應的治療效果。該研究通過成像流式細胞術檢測對比KPL-404對來自健康供體（healthy donor，HD）以及自身免疫疾病患者的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的體外作用。用抗CD3/CD28交聯劑免疫刺激細胞，誘導CD40-CD40L介導的B細胞反應，將檢測的抗CD40 Ab細胞內化與G28-5[33]（一種部分拮抗性抗CD40抗體）的作用進行比較。結果表明，KPL-404在體外不僅能與不同亞群B細胞上的CD40高親和結合，而且不產生任何激動活性，比G28-5的抗性特異性強且只需要1-10 μg/mL就能有效阻斷CD40-CD40L介導的HD的B細胞活化。

單獨用KPL-404處理不會促進細胞因子產生并能抑制某些炎癥細胞因子的產生，而且不影響它們抗IgM反應或細胞因子產生，結果顯示出對B細胞和總PBMC的純拮抗作用。KPL-404能抑制健康對照和自身免疫性患者PBMC培養物中CD40-CD40L介導的B細胞活化，可阻斷致病性B細胞反應，在有效防止自身免疫性疾病發生的研究上做出了貢獻。但施用KPL-404是否能在抑制自身反應性B細胞產生的同時增強其凋亡，或與其他分子抑制劑交聯使用是否能到達更好的效果，以便后期應用于臨床試驗，這是值得進一步研究的問題。

CD154(CD40 配體，TNFSF5）是一種可以傳遞共刺激信號的T細胞分子，CD40-CD154的上調表達發生在不同自身免疫性疾病的免疫效應細胞和非免疫細胞中，其復雜的免疫反應會促進關節炎癥和骨損傷。在膠原誘導性關節炎（collagen induced arthritis，CIA）動物中。阻斷CD40-CD154的相互作用可觀察到治療效果。以前的治療方式是用合成消炎藥來抑制炎癥反應、控制疾病進展并預防自身免疫性關節炎患者的關節損傷[34]，但因其是非特異性藥物，有一群關節炎患者對這些治療并沒有反應，依然遭受持續和不可逆的關節破壞。通過實驗研究[35]可得，抑制CD40-CD154可減弱CD154介導的T細胞共刺激，并抑制CD40介導的對B細胞和抗原呈遞細胞的激活信號，達到抑制致病性B細胞形成的效果。T細胞激活在自身免疫性關節炎的發病機制中起主要作用，有效抑制T細胞的激活是免疫調節治療非常重要和有效的途徑[36,37]，CD40-CD154作為治療自身免疫性關節炎的潛在靶點，對后期的藥物研發具有重要意義。

目前，已經開發了幾種靶向CD40-CD154的生物產品，正在進行相關臨床試驗。Tn3（一種小蛋白質支架）是其中一種能與CD154特異性結合的藥物，被命名為VIB4920。通過臨床前分析結果可得出VIB4920能有效抑制B細胞的活化和分化，且在體外不引起血小板聚集。使用VIB4920治療顯著降低了類風濕性關節炎疾病活動度，超過50%接受兩次更高劑量治療的患者在第12周達到了低疾病活動度或臨床緩解[38]。患者對該藥物表現出良好的耐受性，并且在整個試驗過程中沒有具體的安全性問題。雖然該阻斷劑的治療效果顯著，但其療效和安全性的臨床評估只涉及有限的患者數量，考慮到在檢查阻斷CD40-CD154信號通路治療自身免疫性疾病的長期安全性方面，還需要更多的臨床驗證。

Fas-FasL 與CD40-CD40L都能通過NF-κB信號通路來發揮作用。基于這兩個分子的作用在研發治療關節炎癥等自身免疫性疾病的過程中，應考慮藥物分子在NF-κB信號通路中是否會導致其他細胞因子的激活或炎癥分子的產生。若同時使用Fas激活劑和CD40阻斷劑，是否能使治療效果及可長期使用性達到最優值。除此之外，參與親和力成熟選擇的FDC和影響Ag攝取能力的Lis1因子的作用在預防自身免疫性疾病發生的過程中也具有值得探討的價值。

3 結語與展望

生發中心反應支持了強大的抗體反應[39]，當此過程出現差錯，如自身反應性B細胞克隆的存活、產生自身抗體后與自身抗原結合起免疫反應，會導致自身免疫性疾病的產生。研究[40]發現GC DZ的B細胞群可分為暗區增殖（dark zone proliferation，DZp）群和暗區分化（dark zone differentiation，DZd）群，DZp可協助去除凋亡細胞及有絲分裂前未被陽性選擇的LZ B細胞，可作為一個免疫檢查點，在適宜藥物或分子的靶向療法下以維持凋亡和有絲分裂的穩定，在疫苗設計和調節自身免疫性疾病的適應性體液免疫中具有很大的參考價值。

掌握GC B細胞的應答過程及凋亡調控機制對清除自體反應性B細胞以及促進B細胞親和力成熟至關重要。阻斷刺激性免疫檢查點或激活抑制性免疫檢查點已被用于改善自身免疫性和炎性疾病的免疫反應，增強GC反應是疫苗開發的首要目標[39]，深入了解參與GC反應的相關機制和通路以及目前對治療免疫性疾病的抗體和藥物研究進展，對研究和治療一些自身免疫性疾病提供了依據和建議，具有深遠的重大意義。