原核生物基于環寡核苷酸的抗噬菌體免疫系統研究進展*

吳用宇，張丹丹

（福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117）

在微生物學中探究原核生物對不斷變化的環境和入侵的外來病原作出反應和適應的信號轉導途徑及分子機制是一個重要研究方向。鑒于適應環境的重要性，原核生物利用多樣的策略來完成這一任務，其最重要的方式是利用核苷酸衍生的小分子轉導外部信號的第二信使信號通路，這些小分子第二信使通過改變轉錄、翻譯甚至蛋白活性等發揮整體調節作用，從而導致細菌的生理行為產生變化[2]。原核中基于環寡核苷酸的抗噬菌體免疫系統就是一種新發現的第二信使介導細胞死亡的抗噬菌體系統。

1 原核CBASS的發現

在細菌與病毒（噬菌體）之間的競賽中，噬菌體不斷更新自己的侵染系統攻破細菌的防線，而細菌為防御噬菌體侵染同樣進化出了一系列的防御系統，如眾所周知的CRISPR-Cas，限制性修飾系統等，研究發現細菌的抗噬菌體系統都傾向于集中在原核生物基因組的“防御島”[3]，根據這種與已知防御系統共域化的特性[4]，目前在細菌中發現了多個新型的抗噬菌體系統，如BREX (Bacteriophage Exclusion)、DISARM(defence island system associated with restriction-modification)等[5,6]。環二核苷酸（Cyclic dinucleotides），如c-di-GMP和c-di-AMP等是一類存在于真核細胞、細菌和古細菌的第二信使，特別是cyclic GMP-AMP（cGAMP）在真核細胞和細菌中的發現極大地拓展了我們對于第二信使的認識。真核細胞的cGAMP是由胞內的cGAMP合成酶[c-GMPAMP synthase(cGAS)]mammalian合成的，哺乳動物的cGAMP由一個GTP和一個ATP生成，包含一個2’-OH-磷酸二酯鍵。細菌中的cGAMP是利用GTP和ATP在DncV的催化下產生的，細菌的cGAMP卻有2個3’-OH-5’-磷酸二酯鍵，DncV和cGAS都屬于CD-NTase超家族，但是DncV和cGAS一級序列上沒有同源性。

進一步的研究發現霍亂弧菌中編碼DncV的基因同系物也經常傾向于出現在防御基因附近[4,5,6]， 并且在霍亂弧菌中DncV合成的cGAMP第二信使激活降解細菌內膜的磷脂酶CapV[7,8]，使得細胞膜被降解，膜完整性被破壞從而導致細胞死亡。DncV介導的細胞死亡發生在噬菌體能夠完成其復制周期之前，因此感染細胞中不會出現成熟的噬菌體顆粒，從而使噬菌體不會擴散到附近的細胞。這種寡核苷酸環化酶介導的抗噬菌體防御方式被命名為CBASS（cyclic oligonucleotide-based anti-phage signaling system）[1]。同時CBASS系統的變體廣泛存在于幾乎所有細菌和古細菌的基因組中，并形成一個巨大且高度多樣化的抗噬菌體防御系統家族。一般而言，CBASS系統至少由兩種蛋白組成，第一種蛋白被認為是作為感知噬菌體的存在，然后產生環寡核苷酸信號，第二種是效應蛋白，作為環寡核苷酸信號受體，被激活后發揮細胞殺傷功能。

原核CBASS系統的每個部分都表現出區別于哺乳動物cGAS通路的多樣性，包括寡核苷酸環化酶（cGAS/DncV-like nucleotidyltransferase，CD-NTase）及相對應的多類第二信使、多種效應細胞殺傷因子、輔助調控因子等。

2 CBASS 系統的組成

2.1 CBASS ?中的CD-NTase及產生的第二信使

CD-NTase 是一種酶，可以合成特定的寡核苷酸信號，放大通路信號和控制下游效應反應。CD-NTase在動物和細菌信號系統中是保守的，在先天免疫和抗噬菌體防御過程中發揮至關重要的作用。在人類細胞中CD-NTase能夠識別異常出現在胞質中的dsDNA并與之結合從而激活自身環化酶活性產生2’-5’,3’-5’ cyclic GMP-AMP(2’3’-cGAMP)進而激活下游抗病毒免疫及干擾素信號。在細菌和古菌中，CD-NTase酶在CBASS中同樣作為化學傳感器發揮作用，使細菌細胞能夠對噬菌體的侵染作出反應，并快速啟動信號響應[9]。但是與哺乳動物細胞中的CD-NTase需要與dsDNA結合才能激活的方式不同，細菌中的大多數CD-NTase在沒有配體的情況下具有催化活性，并在體外就可合成環核苷酸信號[10]。如在弧菌屬中的DncV是與類葉酸化合物結合后才受到抑制，包括5-甲基四氫葉酸等核苷酸生物合成所需的代謝物。這表明，細菌中的CD-NTase的調控可以通過抑制酶活性的配體的結合來實現，也提示了這些CD-NTase通過感應細胞內代謝物的消耗或營養饑餓等條件來響應噬菌體感染[11]。在活性狀態下，CD-NTase催化常見的三磷酸核苷酸前體組成環寡核苷酸信號，并進行多循環合成。這種迭代過程使得活性狀態下的CD-NTase能通過相對較少的拷貝產生許多核苷酸第二信使分子，并顯著放大信號響應。

CD-NTase 的結構進一步闡釋CD-NTase產生環寡核苷酸信號的具體分子機制及總體特征。如大腸桿菌RmCdnE與非水解ATP和UTP復合物的結構顯示天冬酰胺側鏈(Asn166)與尿嘧啶堿基形成氫鍵，并將ATPαP定位于UTP的3′-羥基處進行攻擊Asn166位于DncV和cGAS受體核苷酸口袋中絲氨酸殘基的相同位置，并且在CdnE同系物中Asn166幾乎是高度保守的。野生型CdnE合成cUMP-AMP，而當將CdnE N166變成S166后該位點幾乎失去利用UTP的活性，但并未失去合成環寡核苷酸的活性，而是主要合成c-di-AMP。當在此位置重新引入原先的天冬酰胺則CdnE回到優先生產含嘧啶的產物。這種天冬酰胺取代足以決定CdnE產物的特異性[12]。

幾乎所有CD-NTase都有三個共同的特征：⑴一個共同的DNA聚合酶β樣核苷酸轉移酶超家族的蛋白折疊 ；⑵ 通過活性位點的口袋，使用不保守的蛋白支架與更遠的相關模板聚合酶進行可擴散分子的模板依賴性合成；⑶ 活性位點的結構允許通過活性位點蓋子內的氨基酸替換使產物和磷酸二酯連接多樣化。

由于活性位點蓋子延伸的側鏈中存在高度的氨基酸序列變異性，此變異性為CD-NTase提供識別不同化學配體和合成具有替代堿基及磷酸二酯連接特異性的不同核苷酸產物所必需的可塑性[13,14]。目前，已知的CD-NTase產物包括二嘌呤、二嘧啶，除環二核酸外CD-NTase也產生線性寡核苷酸和更大的環狀核苷酸包括規范的 3’-5’磷酸二酯和不規范的2’-5’磷酸二酯連接方式的環狀三核苷酸。鑒于CD-NTase的多樣性，很可能還有更多類型的第二信使有待發現。

2.2 四類CBASS操縱構型

在CBASS系統中不僅存在大量不同的環寡核苷酸第二信使，同時還擁有龐大且復雜的調控組分，這些不同調控組分根據其結構域的不同，形成四類不同構型的調控系統。在各類不同的構型中，雖然許多調控組分發揮的具體功能及分子機制仍未知，但是這些不同組分已經被證明是組成CBASS系統各類構型所必不可少的。

I 型CBASS由一個緊湊的雙基因系統組成。該系統具有僅由CD-NTase基因和效應基因組成的最小配置，并無其他相關輔助基因，這是在原核生物中存在最為廣泛的CBASS構型，幾乎可以在所有主要細菌門類中發現I型CBASS構型的存在[1]。大多數I型CBASS系統中的效應因子含有一個或七個跨膜螺旋，預測一旦被環寡核苷酸信號激活，就會在膜中形成孔隙[15]。

II 型CBASS在CD-NTase基因和效應基因組成的基礎上還包括兩個編碼真核經典泛素化相關結構域的基因，其中，兩個輔助因子被稱為cap2和cap3[16]。cap2中包括真核經典泛素激活的E1酶結構域和泛素結合的E2酶結構域，而cap3僅編碼一個蛋白結構域，該結構域通常發現于真核生物去泛素化酶中，且被預測為是JAB/JAMM家族的異肽酶，該酶可將泛素從靶蛋白中去除。由于cap3的基因較短，在少數II型CBASS系統中存在cap2和cap3的基因融合或cap3的基因與效應基因融合的情況。同時，有小部分II型CBASS系統具有更小的構型，即除環化酶及效應子對外，僅包括一個短的E2結構域的基因，不包括E1或JAB。

十分有趣的是，cap2和cap3是抵御部分但不是所有噬菌體所必需的，表明這些基因在CBASS系統中具有輔助功能，擴大系統抵御噬菌體的范圍。但是，對于cap2和cap3的靶向分子機制并未被闡釋清楚，目前也尚缺乏哪種蛋白是cap2和cap3輔助編碼的泛素處理結構域靶標的證..據，同時，對于僅包含E2結構域基因的亞型，尚不清楚其是單獨發揮作用，還是利用細胞中的其他基因來填補缺失的E1和JAB結構域功能。在II型CBASS系統中最常見的效應結構域是一種磷脂酶結構域，這種磷脂酶一旦被信號分子激活就會降解細菌內膜。

III 型CBASS在寡核苷酸環化酶和效應基因組成的基礎上還包括編碼HORMA和TRIP13結構域的基因，這些輔助編碼的結構域迄今為止也都是主要在真核生物中被發現的[17]。其中一個因子cap7是具有HORMA結構域的蛋白，這類蛋白形成信號復合物控制真核生物減數分裂、有絲分裂和DNA的修復[18]；第二個因子cap6具有TRIP13結構域（也稱為Pch2結構域），這是一種已知的HORMA結構域蛋白活性抑制劑[19]。在真核生物中，TRIP13蛋白解離HORMA信號復合物，使得信號關閉。

在III型CBASS中HORMA結構域蛋白(Cap7)對于噬菌體防御至關重要，并且寡核苷酸環化酶只有在與HORMA結構域蛋白（Cap7）物理結合時才會變得有活性。相比之下，TRIP13結構域蛋白Cap6發揮著從寡核苷酸環化酶中解離HORMA結構域蛋白的作用，表明TRIP13是環寡核苷酸產生的負調控因子。在正常條件下，Cap6阻止Cap7與寡核苷酸環化酶結合；然而在噬菌體感染期間，Cap7識別感染（可能通過與噬菌體編碼蛋白結合）并改變構象從而與寡核苷酸環化酶結合。這種結合激活環狀寡核苷酸分子的產生，進而激活效應蛋白導致細胞死亡，使噬菌體無法完成其復制周期[20,21]。而III型CBASS在變形菌門中被過度表達，在厚壁菌門中卻幾乎不存在，在III型CBASS中除了一種具有單一的HORMA結構域蛋白（cap7）外，還存在另外一種HORMA結構域的蛋白。僅通過基于結構的比較而不是基于序列的比較，其中的一種蛋白Cap8與正常HORMA結構域相比存在相當大的差異，這種不同的Cap8的HORMA結構域在體外不能激活環化酶，猜測其可能作為腳手架的方式發揮作用。

IV 型CBASS在寡核苷酸環化酶基因和效應基因組成的基礎上還包括具有核苷酸修飾結構域的輔助蛋白基因，通常IV型CBASS中的輔助因子由cap9和cap10組成，這兩個蛋白是具有參與核苷酸修飾的結構域。cap9具有一個預測的QueC酶結構域，已知該結構域可將修飾的堿基7-羧基-7-脫氮鳥嘌呤（CDG）轉化為7-氰基-7-脫氮鳥嘌呤（preQ0）[22,23]。cap10被預測是一種TGT酶，這類酶催化tRNA分子中特定的鳥嘌呤殘基與preQ0的堿基交換[24]，且可以修飾DNA上的鳥嘌呤殘基[25]。

在IV型CBASS系統中也存在另一個被注釋為N-糖基化酶/DNA裂解酶（OGG）的基因（cap11）。根據目前已知N-糖基化酶/DNA裂解酶可去除DNA中受損的鳥嘌呤堿基（8-oxoG），并在脫嘌呤/脫嘧啶位點使DNA產生缺口[26]。迄今為止，還沒有IV型CBASS系統通過證實能防御噬菌體，其輔助基因的確切功能仍不清楚，且IV型CBASS系統較集中存在于古細菌中。

CBASS 系統中的這四類輔助操縱構型復雜且精密，而且其中許多組分結構域在之前是僅在真核細胞中發現的，同時還有許多的猜想和問題需要被驗證和解釋。這些調控組分可能作用于CBASS系統中的各個不同的階段以達調控該系統的穩態，最終則由效應殺傷因子負責整個系統表觀功能上的表達。

2.3 CBASS 中的效應殺傷因子

CBASS 系統中的多類效應殺傷因子作為整個系統中的最終效應因子，通過各類殺傷手段使細胞出現提前死亡的現象，其效應蛋白通常由兩個結構域組成，包括環寡核苷酸感應結構域和細胞殺傷結構域。通過目前已知的結構及序列分析，CBASS中的效應殺傷因子包括一個以前未被表征過的SAVED結構域和各類型的殺傷結構域，其中新發現的SAVED結構域負責識別環寡核苷酸信號。以cap4為例，從結構上看C-末端SAVED結構域與CRISPR相關的CARF結構域蛋白有明確結構同源性，由兩個單獨的CARF樣亞基形成偽對稱的形式存在，這樣的偽對稱形態使SAVED結構域的單鏈結構允許識別不同的不對稱核苷酸識別信號。N端結構域則是廣泛存在于細菌中的未表征蛋白結構域4297(DUF4297)的成員，且該DUF4297結構域與II型限制性內切酶具有結構同源性，包括AgeI和HindIII酶等，發揮著降解dsDNA的殺傷作用。

影像融合首先用QuickBird多光譜影像和全色影像進行幾何配準；然后分別采用彩色合成變換［4］、IHS 變換、K-L 變換［5,6］和 Brovey 變換［7］進行融合處理；最后通過統計平均值、標準差、偏差指數、信息熵和相關系數，比較不同方法［8］的融合效果。

效應殺傷結構域除了該類核酸內切酶外還包括能降解內細胞膜磷脂的patatin-like磷脂酶結構域、能夠造成細胞膜穿孔的跨膜螺旋結構域、能降解蛋白的肽酶結構域、與Thoeris抗噬菌體系統相關的TiR結構域及少數的磷酸化酶/核糖核酸酶結構域。

CBASS 效應殺傷因子依靠這兩個結構域分兩步發揮作用。其中環寡核苷酸感應結構域一旦感知到環寡核苷酸就會被激活，隨后使各類細胞殺傷結構域作用于相應靶標，對細胞產生殺傷作用，從而使細胞死亡。各類不同的殺傷結構域根據其不同的特性發揮其特有的功能對細胞產生殺傷作用。

3 總結與展望

cGAS 途徑是首先發現于真核生物中的一個至關重要的抗病毒免疫通路。而細菌中的CBASS系統是在原核生物中被發現并揭示的一種CD-NTase介導的全新的抗病毒（噬菌體）機制，根據目前的研究，CBASS系統由三大部分構成，分別是寡核苷酸環化酶（CD-NTase）、四類型操縱子及各類不同的下游殺傷性效應因子。

噬菌體感染細胞的某些信號使得寡核苷酸環化酶（CD-NTase）激活產生第二信使將信號傳遞下去，同時在CBASS中四種不同構型的操縱子也對該系統的運作及調控發揮重大作用。在CD-NTase產生不同類型的環寡核苷酸第二信使后，這些環寡核苷酸信使被相應效應殺傷因子的SAVED結構域所識別，之后便會激活相應各類不同的殺傷結構域通過各種不同的殺傷方式使細胞提前死亡，以此來阻止噬菌體的成熟，從而達到抗噬菌體的目的。

原核CBASS系統的揭示為之前僅在哺乳動物中發現的cGAS-STING抗病毒途徑拓展了一個全新的研究大方向，并且已經有越來越多的證據表明，原核CBASS系統與cGAS-STING通路存在進化上的關聯，哺乳動物cGAS-STING通路極有可能是原核CBASS系統演變進化形成的。但是，目前這個新型的抗噬菌體防御系統仍有許多未知的謎題等待被發掘和解釋，如CBASS系統中的CD-NTase到底是如何感應噬菌體的入侵從而轉化為激活態，因為原核細胞胞質中游離著自身的dsDNA，其大概率不同于哺乳動物cGAS通路那般通過識別胞質dsDNA來實現激活，且大多數CD-NTase在體外沒有其他配體的情況下具有催化活性，其在細胞內的激活與否必然依靠著其他不同的方式，但這仍需大量的研究來揭示和證明。

四類型豐富且復雜的調控模塊的研究及闡釋則仍處于相對空白的階段，這些發現在真核生物中的結構域在原核生物中又具體發揮什么樣的作用，如此多樣且復雜的操縱模塊究竟是如何作用于CBASS的調控等這些問題也仍需要大量的分析和深入的研究來解答。作為CBASS中最終的效應殺傷因子同時也有著多樣的殺傷結構域，其不同的殺傷分子機制也仍待揭示。對CBASS系統的深入研究不僅是對原核中這種新型抗噬菌體系統的揭示與探究，由于其與哺乳動物cGAS-STING通路在進化上的緊密關聯，使其更可能有著與哺乳動物cGAS-STING通路相關研究互相照應、互相提示的重大意義。