放射治療后宮頸癌組織內差異表達基因鑒定

白 靜，劉 娜，丁 力，雷 麗，倪 瑞，閆少春，邵 國

(1.包頭市腫瘤醫院 放射治療科，內蒙古 包頭 014030； 2.包頭醫學院 內蒙古自治區低氧轉化醫學重點實驗室，內蒙古 包頭 014060; 3.首都醫科大學 宣武醫院 低氧適應轉化醫學北京重點實驗室，北京 100053；4.包頭醫學院第二附屬醫院 內蒙古自治區消化疾病研究所 檢驗科，內蒙古 包頭 014030)

宮頸癌(cervical cancer)是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤，是全球范圍內65歲以上女性第二常見腫瘤[1-2]，也是導致婦女死亡的重要原因。近些年隨著放療技術不斷更新、同期放化療方案的使用及靶向藥在宮頸癌腫瘤治療中的使用，使宮頸癌患者治療的有效率提高，生存期延長，但是相同病理類型和不同病理類型的宮頸癌給予相同放療劑量療效仍存在差異，相同病理類型和不同病理類型間放射敏感性存在差異，存在放射抗拒，腫瘤放射抗拒仍是影響腫瘤放射治療療效的重要因素[3]。

高通量測序又被稱為二代測序(next generation sequencing,NGS)，已被作為一種有效的工具，用于篩選和鑒定通過轉錄組測序發現的可能的疾病治療的潛在靶點[4]。 本研究利用放射治療宮頸癌，外照射結合近距離照射宮頸癌組織，通過高通量測序找出差異表達的基因，利用生物信息學對數據進行分析，并通過實驗進行部分驗證，以期為宮頸癌的放射治療及放射抗拒分子機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：Trizol、反轉錄試劑盒、蛋白BCA定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；GADD45A，GADD45B和GADD45G抗體(Abcam公司)；鼠β-肌動蛋白(β-actin)抗體(三塔生物科技公司)；PVDF膜(羅氏生物科技有限公司)；引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.1.2 宮頸癌樣本：收集2018—2019年在包頭市腫瘤醫院進行放射治療的16例宮頸癌樣本。本研究經患者簽署知情同意書并由醫院倫理委員會批準(批準文號：20180307)。

1.2 方法

1.2.1 樣本的分組及照射：每一例患者都給予相同的放療模式：全盆腔外照射結合腔內近距離治療，全盆外照射總劑量45戈瑞(Gray,Gy)/25次(frequency，f)；腔內近距離治療5～6 Gy /次(f),共治療5～6次(f)。每一例患者的3組樣本分別為外照射結合近距離治療前(before)、治療中(近距離治療3次，three)和治療結束(after)留取標本。

1.2.2 宮頸癌放射治療的生物信息學分析:近距離治療前、治療3次后和治療結束后3組樣本送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行mRNA表達的高通量測序，差異表達結果在美吉生物云平臺(cloud.majorbio.com)進行生物信息學分析。

1.2.3 Real-time PCR 檢測GADD45 mRNA水平:取50mg宮頸癌樣本組織，使用Trizol法提取總RNA，并使用Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit將其反轉錄成cDNA，使用ABI 7900實時熒光定量PCR儀和SYBR染料法檢測各組GADD45和β-actin mRNA情況，根據2-△△Ct計算相對表達量。引物序列如下：GADD45-A上游引物：5′-GAGAGCAGAAGACCGAAAGGA，下游引物：5′-CAGTGATCGTGCGCTGACT-3′；GADD45-B上游引物：5′-TACGAGTCGGCCAAGTTGATG-3′，下游引物：5′-GGATGAGCGTGAAGTGGATTT-3′；GADD45-G上游引物：5′-CAGATCCATTTTACGCTGATCCA-3′，下游引物：5′-TCCTCGCAAAACAGGCTGAG-3′；β-actin上游引物：5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′，下游引物：5′-GGTCATTGATGGCAACAA-3′。

1.2.4 免疫印跡檢測GADD45蛋白水平:使用RIPA裂解液提取總蛋白質，使用BCA法檢測蛋白質濃度，每組蛋白樣品取10 μg加入聚丙烯酰胺凝膠各泳道中，5%濃縮膠19 mA電泳30 min，12%分離膠29 mA電泳3 h后，使用轉膜儀400 mA轉膜過夜將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質轉移到PVDF膜上，5%牛奶封閉1 h，將GADD45A、GADD45B、GADD45G和β-actin一抗1∶1 000稀釋，4 ℃過夜孵育，TBST清洗3次，山羊抗鼠/驢抗兔二抗1∶1 000稀釋孵育1 h，加入ECL發光并使用化學發光儀采集圖像[5]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 放射治療宮頸癌的生物信息學分析

治療中(three)組和治療后(after)組與治療前(before)組，差異表達的基因超過15 000個(圖1)。而具體分析表達量高于1的基因，治療中(three)組和治療后(after)組與治療前(before)組相比上調基因在6 500以上，下調基因都在100個以下(圖2)，放射治療的主要作用體現為上調基因表達。將放射治療前(before)、治療中(three)組與治療后(after)差異表達的基因進行GO分析(圖3)，差異表達基因主要集中在整體基因組核酸切除修復，整合素調節的細胞黏附，血管重塑，間充質細胞增殖，等等。

圖1 內放射治療宮頸癌前(before)，治療3次(three)和治療后(after)基因差異表達Venn圖Fig 1 Venn diagram analysis of differentially expressed genes in cervical cancer specimen collected before, after and three times radiotherapy treatment

圖2 內照射治療宮頸癌前(before)，內照射治療3次(three)和治療后(after)基因差異表達兩兩比較火山圖Fig 2 Volcano plots demonstrating differentially expressed genes in cervical cancer specimen collected before,after and three months radiotherapy treatment

圖3 外照射結合內照射治療宮頸癌前(before)，外照射結合內照射治療3次(three)和外照射結合內照射治療結束后(after)基因差異表達GO富集分析圖Fig 3 GO enrichment analysis differentially expressed genes in cervical cancer specimen collected before,after and three months radiotherapy treatment.

2.2 放射治療增加DNA損傷修復基因表達

對3組差異表達的基因根據GO分析結果，將與DNA損傷修復的基因進行列表發現three/before的比值：3～19，而last/before的比值：2.2～9，three/last的比值：0.8～3.6。因此外照射結合內照射治療上調DNA損傷修復基因的表達，治療結束后表達會下調(表1)。

表1 差異表達的13個DNA損傷相關基因表Table 1 13 differentially expressed genes related to DNA damage

2.3 放射治療對宮頸癌組織GADD45表達的影響

內照射治療3次組(three)和治療后組(after)、治療前組(before)相比，GADD45α，β和γ的mRNA的相對豐度增加(P<0.05)；治療后組(after)與內照射治療3次組(three)相比，GADD45α，β和γ的mRNA的相對豐度降低(P<0.05)。

內照射治療3次組(three)與內照射治療前組(before)相比，GADD45α，β和γ的蛋白的相對豐度增加(P<0.05)；治療后組(after)與內照射治療治療前(before)相比，GADD45α和β的蛋白表達增加(P<0.05)(表2，圖4)。

表2 放射治療對GADD45 mRNA和蛋白表達的影響Table 2 The effect of radiotherapy on the expressions of GADD45 mRNA and

圖4 Western blot檢測內照射治療宮頸癌前(before)，內照射治療3次(three)和治療后(after)GADD45α，β和γ基因表達水平檢測Fig 4 Western blot detecting the expression of GADD45α，β and γ in cervical cancer specimen collected before,after and three months radiotherapy treatment(n=6)

3 討論

宮頸癌(cervical cancer，CC)是女性中常見癌，2020年全球每年共有52萬多例新病例和26萬多例死亡病例[6]，中國女性宮頸癌約占世界新發病例的30%[7]。放射治療(radiation therapy，RT)和手術是宮頸癌的主要治療方式，其中放射治療可以殺死腫瘤細胞，使腫瘤的體積縮小，有效控制腫瘤[8]。利用生物信息學可間接估計靶組織對放射治療的敏感性[9]，而二代測序技術結合生物信息學可作為宮頸癌前體的有前景的篩選技術[10]。本研究主要通過生物信息學討論放射治療宮頸癌對宮頸癌組織基因表達的影響。

本研究利用生物信息學發現DNA損傷誘導基因在近距離內照射治療3次后表達增加，其中對生長阻滯和DNA損傷誘導基因45(The Growth Arrest and DNA Damage-inducible 45，Gadd45)3種蛋白，即GADD45α，β和γ在核酸水平和蛋白水平進行了驗證：近距離治療3次之后表達增加，治療全部結束后較治療前水平增加但較近距離治療3次后表達大部分降低(11/13)。DNA損傷后，所有GADD45蛋白家族成員均被迅速誘導，導致細胞周期停滯和/或凋亡，或者它們積極參與DNA修復機制。 由于GADD45蛋白與癌的發生和發展有關，因此被廣泛研究[11]。GADD45α、GADD45β和 GADD45γ是GADD45成員，它們是細胞周期、衰老、存活和凋亡的調節蛋白。Gadd45蛋白促進活性DNA去甲基化，從而介導基因激活。從機制上講，Gadd45充當基因特異性位點的DNA修復因子的銜接子，以促進DNA去除5-甲基胞嘧啶[12-14]。 因此，Gadd45是DNA修復與表觀遺傳基因調控之間的紐帶。

本研究通過生物學信息學發現宮頸癌接受外照射結合內照射治療可以顯著改變包括GADD45在內的多種基因的表達。實驗驗證GADD45的變化與生物信息學分析結果一致。有報道顯示GADD45放射誘導表達降低的患者其放射治療效果較好[15]。而外照射結合內照射治療是如何影響眾多基因表達改變和其中的生物機制不明確，希望以后利用生物信息學進一步挖掘數據。同時，治療發生的電離輻射導致DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSB)時才可以導致瘤細胞致死性損傷，但腫瘤細胞可以有效修復DSB，腫瘤細胞有效修復DSB的能力明顯影響放射治療療效。GADD45的誘導表達變化是如何影響治療效果，需要通過以后的進一步實驗找出宮頸癌放射治療和放射耐受的作用機制，為臨床宮頸癌的治療提供潛在分子靶點。