細胞周期蛋白依賴性激酶亞基2通過干預線粒體功能促進宮頸癌細胞增殖機制研究

王 靜，袁 淵，周 敏，李 妘

(1.陜西省腫瘤醫院婦瘤科,陜西 西安 710061；2.漢中市中心醫院婦科,陜西 漢中 723000)

宮頸癌是最常見的女性生殖系統惡性腫瘤，也是病死率居第二位的婦科腫瘤[1]。盡管早期宮頸癌患者行手術或放療等局部治療手段可取得良好療效，但是中晚期宮頸癌患者多死于腫瘤侵襲及轉移，導致預后不良[2]。已有研究[3]顯示無淋巴結轉移的早期宮頸癌患者的5年生存率在85%以上，而伴淋巴結轉移的相同臨床分期的患者5年生存率低于50%。因此，研究宮頸癌的早期診斷以促進改善患者的預后一直是我國婦科腫瘤學的重點。細胞周期蛋白依賴性激酶亞基(Cyclin-dependent kinase subunit，CKS)蛋白家族大量存在于哺乳動物細胞中，CKS2為CKS蛋白家族的重要一員，由79個氨基酸構成，具有81%的同源性[4-5]。人體CKS2基因位于人類染色體9q22上，具有促進腫瘤增殖的作用[6]。有研究[7]表明CKS2與多種惡性腫瘤的臨床分期、淋巴結轉移與組織學分化存在相關性，可在多種惡性腫瘤中CKS2通過正向調控細胞周期、侵襲和轉移來促進腫瘤的進展，但是具體的作用機制還不明確。線粒體通過自身融合、分裂可影響自身的形態與功能，從而參與調節細胞的生物學行為。比如線粒體的分裂不僅可以生成新的線粒體，還可以在數秒內改變位置、形態與大小，還可以通過清除功能異常與損傷的線粒體以保證其正常的生理功能[8]。線粒體整合蛋白2(Mitofusin 2,Mfn2)是反應機體線粒體功能的重要蛋白，與線粒體的分裂和融合密切相關，也是一種定位在線粒體外膜的具有GTP酶活性的蛋白[9-10]。本文探討了CKS2蛋白通過干預線粒體功能促進宮頸癌細胞增殖的機制，希望為明確CKS2蛋白的作用效應提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SiHa細胞購置于上海中科院(在10%胎牛血清的DEME培養基內,37 ℃、5% CO2孵箱中培養，培養2～3 d后進行傳代,取生長狀態好、對數生長期的細胞用于實驗),轉染試劑盒購自美國Sigma公司，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自上海碧云天生物技術有限公司,MTT檢測試劑盒購自上海生工公司。丙烯酰胺購自北京索萊寶生物工程有限公司，胎牛血清、DMEM培養基購自美國Hyclone公司，β-actin 單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，細胞消化酶、雙抗購自美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞瞬時轉染：對數生長期的SiHa細胞設三組：空白對照組(不進行轉染)、陰性對照組(轉染Hs-NC siRNA)與CKS2 siRNA組(轉染Hs-CKS2 siRNA)。0.25%胰酶消化90%生長密度的SiHa細胞，800 r/min 離心5 min后進行懸浮，然后接種到96孔板。培養24 h后進行Hiperfect Transfection Reagent轉染，嚴格按照試劑盒進行操作，轉染4～6 h后吸棄96孔板培養液，然后進行常規培養。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖活性：轉染后制備出細胞懸液，按照每個孔細胞數為5×103個進行接種到96孔板。培養24 h后，每孔加入MTT溶液20 μl，繼續培育4 h。吸棄孔內培養液，添加 DMSO，然后執行10 min的振蕩操作，使得結晶溶解充分，利用酶標儀檢測對490 nm波長位置進行檢測，計算細胞增殖指數。

1.2.3 Transwell檢測細胞侵襲及轉移：轉染后制備出細胞懸液，取200 μl細胞懸液加入到Transwell小室，在Transwell小室的下室加入500 μl含血清的DMEM培養基。培養24 h后取出小室后進行細胞固定，結晶紫染色后進行倒置鏡下觀察，記錄與計算細胞侵襲及轉移指數。

1.2.4 線粒體膜電位檢測：轉染后制備出細胞懸液，加入1×JC-1染色工作液混勻，避光孵育30 min。然后再用1×JC-1染色緩沖液洗滌2次(每次5 min左右)，再加入1×JC-1染色緩沖液重懸細胞，用線粒體膜電位檢測試劑盒檢測，用平均熒光強度表示線粒體膜電位變化。

1.2.5 qPCR檢測CKS2與Mfn2 mRNA表達水平：轉染后提取細胞總RNA，取1 ng RNA進行反轉錄反應得到cDNA，采用qPCR方法檢測CKS2與Mfn2 mRNA表達水平，CKS2上游引物5’-ACGTTAACCGGAAACCTTATGGCCG-3’，下游引物5’-GGTCCCGGGCCTTTGTCATTT-3’。Mfn2：上游引物5’-GAATGAAACCTTAGCTGCAAGCA-3’，下游引物5’-CACAGTGGCTTTGACCCCAGCCGAACAA-3’。

1.2.6 Western blot法檢測Mfn2、CKS2蛋白表達水平：轉染后提取細胞總蛋白，沸水浴變性5 min，蛋白上樣選用50 μg，通過SDS-PAGE實現分離，對蛋白進行點轉移，轉到硝酸纖維素膜之上， 5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗(抗Mfn2抗體、抗β-actin抗體、抗CKS2抗體)4 ℃培養過夜，TBST洗膜，二抗室溫培養1 h，TBST洗膜，采用增強型化學發光(ECL)試劑盒進行曝光處理，以β-actin 作為內參計算相對表達量。上述所有實驗都采用3復孔計算，記錄平均值。

2 結 果

2.1 三組細胞增殖指數對比 轉染后24、36 h，CKS2 siRNA組的細胞增殖指數低于陰性對照組、空白對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 三組細胞增殖指數對比(%)

2.2 三組細胞侵襲及轉移指數對比 轉染后24、36 h，CKS2 siRNA組的細胞侵襲及轉移指數低于陰性對照組、空白對照組(均P<0.05)，見表2。

表2 三組細胞侵襲及轉移指數對比(%)

2.3 三組線粒體膜電位水平對比 轉染后24、36 h，CKS2 siRNA組的細胞線粒體膜電位水平高于陰性對照組、空白對照組(均P<0.05)，見表3。

表3 三組線粒體膜電位水平對比(平均熒光強度)

2.4 三組CKS2與Mfn2 mRNA相對表達水平對比 轉染后24、36 h，CKS2 siRNA組的CKS2與Mfn2 mRNA相對表達水平低于陰性對照組、空白對照組(均P<0.05)，見表4。

表4 三組CKS2與Mfn2 mRNA相對表達水平對比

2.5 三組CKS2與Mfn2蛋白相對表達水平對比 轉染后24、36 h，CKS2 siRNA組的CKS2與Mfn2蛋白相對表達水平低于陰性對照組、空白對照組(均P<0.05)，見表5。

表5 三組CKS2與Mfn2蛋白相對表達水平對比

3 討 論

宮頸癌是女性生殖器常見腫瘤之一，雖然當前醫學技術有所提高，但是宮頸癌的5年生存率有待提高。對于晚期有遠處轉移的宮頸癌患者，失去了手術治愈的機會，傳統放療與化療的效果也不佳，在臨床上多采用對癥性支持治療或姑息性治療，尋找靶向治療方法也具有重要的意義[11]。有研究顯示宮頸癌的CKS2蛋白表達水平與患者的病理特征、預后存在相關性，CKS2可通過影響p27蛋白泛素化降解來發揮作用，還可參與調節細胞的凋亡過程[12]。本研究顯示轉染后24 h與36 h，CKS2 siRNA組的細胞增殖指數、細胞侵襲及轉移指數低于空白對照組、陰性對照組,表明抑制CKS2的表達可抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲與轉移。從機制上分析，抑制CKS2的表達可使得腫瘤細胞的增殖速度減慢，細胞平均凋亡率增加，細胞S期比率增加，從而發揮抑癌作用[13]。還有研究表明CKS2蛋白可參與調節乳腺癌細胞的凋亡狀況，也可通過保護內分泌組織癌變、細胞免受程序性死亡來調節細胞凋亡[14]。

宮頸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，由于其早期發病比較隱匿，導致很多患者無法在早期進行手術治療，需要尋找其他治療方法?，F代研究表明腫瘤在發生與發展過程中包含了許多治療靶點，針對某些治療靶點進行針對性治療可能成為治愈宮頸癌的有效方法和途徑之一。線粒體可通過分裂和融合不斷地影響著線粒體的形態，Mfn2位于線粒體膜外，可通過參與線粒體的形態的調節來維持線粒體網絡功能的運行，也被證實是細胞增殖及凋亡信號轉導通路中的重要調控點[15]。Mfn2可以減弱線粒體膜的穩定性，促使線粒體通透性孔隙開放，使線粒體外膜生成孔隙。抑制Mfn2的表達可維持線粒體片段化，抑制線粒體的融合，從而對細胞凋亡發揮重要的調節作用。本研究顯示轉染后24、36 h，CKS2 siRNA組的細胞線粒體膜電位水平高于空白對照組、陰性對照組,表明抑制CKS2的表達可提高細胞線粒體膜電位水平。線粒體膜電位的改變是線粒體參與內源性凋亡途徑中的重要信號，也是細胞增殖轉導通路中的一個重要調控點。有研究表明CKS2具有促進腫瘤細胞增殖的作用，可通過影響p27蛋白泛素化降解來發揮作用，還可以對線粒體外膜通透進行調節，影響腫瘤細胞的凋亡功能[16]。

Mfn2為一種增殖基因，當前被認為是治療腫瘤等疾病的靶點。從生物結構上分析，Mfn2包含有GTP結合位點、跨膜區、PKA/PKG磷酸化位點、P21Ras結構域等。Mfn2可抑制血管平滑肌細胞增殖，使其停滯于G0/G1期[17]。Mfn2定位于線粒體外膜，參與了線粒體形態的調節，還可以調節線粒體膜的穩定性，促使線粒體通透性孔隙開放[18-19]。Mfn2還可與促凋亡分子Bax共定位于線粒體，從而影響Bax蛋白的表達[20]。本研究顯示轉染后24 h與36 h，CKS2 siRNA組的CKS2與Mfn2 mRNA、蛋白相對表達水平低于空白對照組、陰性對照組,表明抑制CKS2的表達可抑制宮頸癌細胞Mfn2的表達。

總之，抑制CKS2的表達可通過干預線粒體膜電位水平，抑制宮頸癌細胞Mfn2的表達，從而抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲與轉移。