NF-κB、villin蛋白的表達與胃癌臨床病理特征及患者預后的相關性

張海梅 張嘉剛 易敏 楊世榮 馬苑寧

(青海省第五人民醫院，青海 西寧 810000)

胃癌(gastric cancer，GC)是全球癌癥相關死亡的主要原因之一。綜合治療策略大大提高了患者的治療效果，但大多數胃癌患者的預后仍然較差[1]。相關研究[2]發現，惡性腫瘤大多由于長期炎癥發展形成，Gagliani等人提出“炎癥—腫瘤”假說，并作出相關研究。絨毛(villin)蛋白是一種鈣調節的肌動蛋白結合蛋白，在正常成人組織中，在小腸黏膜，腎近端小管，肝內膽管，胰管，膽囊上皮等的上皮細胞中觀察到絨毛蛋白的表達。實驗[3]證明，絨毛蛋白被認為是最重要的腸道分化之一標記。本課題主要研究NF-κB、villin蛋白的表達與胃癌臨床病理特征及患者預后的相關性。

1 材料與方法

1.1臨床材料 從我院收集2015年1月至2018年12月接受胃癌根治性切除術患者的胃癌組織36例，及鄰近正常癌旁組織36例(對應胃癌患者的正常組織)。同時選36例健康者為對照組進行社會學人口特征的對比，見表1。TNM分期根據美國癌癥聯合委員(AJCC)第8版分期系統進行分類[4]，所有數據進行匿名分析，研究經我院倫理委員會批準，患者均知情同意。

表1 社會學人口特征比較

1.2主要試劑 兔抗人NF-κB單克隆抗體，購于美國Abcam公司；鼠抗人villin單克隆抗體，購于上海研生生化試劑有限公司；免疫組化試劑盒，購于上海研生生化試劑有限公司。無水乙醇、二甲苯、DAB染色液、蘇木素復染液、PBS緩沖液、中性樹膠等。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學法 將石蠟包埋組織切片用于實驗研究。組織切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中進行脫蠟，之后放入無水乙醇、90%、80%、70%的酒精中進行水化，沖洗凈后放入PBS緩沖液中浸洗3次，5 min/次，擦干后每片樣品滴加200 μL的一抗，4℃冰箱孵育過夜。取出后37℃恒溫復溫，PBS緩沖液洗凈，擦干后每片樣品滴加200 μL的二抗Envisioon，37℃恒溫孵育30 min，結束后，用PBS緩沖液洗凈擦干，將新配的DAB溶液對樣品進行染色，顯色后洗凈，再用蘇木素復染液染色樣品2 min，清水洗凈再用過酸酒精酸化，放入清水中反藍，樣品依次放入70、80、90和無水乙醇中，各放置5 min，再放于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各5 min，37℃恒溫箱中烘干，采用中性樹膠封片。

1.3.2Western blotting檢測 使用RIPA緩沖液(Solarbio，R0010，Shanghai，China)和抑制劑混合物(Sigma，P8340-5ML，St.Louis，MO，USA)提取細胞和組織的總蛋白質并測定通過BCA蛋白質測定法測定蛋白質濃度(SBJ-1001; Beyotime，SENBEIJIA Bio，NanJing，China)。加入上樣緩沖液以調節濃度。變性后，向每個樣品孔中加入20 μg。使用12%SDS /PAGE分離蛋白質樣品，然后在電泳和跨膜后用PVDF膜轉移相應的蛋白質，用脫脂乳密封2 h。將膜與抗β-actin(2146,1∶1000; Danvers，MA)一起孵育初級抗體。β-actin用作上樣對照。使用ECL化學發光著色劑(Haigene，M2301，Harbin，China)使條帶可視化。

1.4患者隨訪 對所有患者手術后進行上門或者電話隨訪，時間間隔為：每兩個月隨訪1次。對患者的術后主要癥狀、身體檢查、CT、PET-CT、及實驗室常規化驗檢查進行了解和統計。此次試驗將隨訪截止時間設定至2019年8月，無失訪患者，隨訪率為100%。

2 結 果

2.1胃癌患者的臨床病理參數 胃癌患者的臨床病理參數見表2。

表2 胃癌患者的臨床病理參數

2.2免疫組化表達情況 NF-κB、villin蛋白表達在組織中染為棕褐色，NF-κB在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)；villin蛋白在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見圖1。

圖1 NF-κB、villin蛋白表達的比較

2.3Western blotting表達 NF-κB在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)； villin蛋白在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見圖2。

圖2 WB檢測NF-κB、villin蛋白表達的比較

2.4NF-κB、villin蛋白的表達與臨床病理的關系 結果顯示，NF-κB在胃癌組織上的表達與性別、年齡、WHO分型無關；與浸潤深度、有無腫瘤轉移、臨床病理分期相關。隨著浸潤深度逐漸加深，從T1-T4，NF-κB表達從0%增加至20.0%、50.0%，與臨床病理呈正相關；腫瘤存在遠處轉移的NF-κB表達(3/4，75.0%)比未轉移(16/32，50.0%)逐漸升高，與臨床病理呈正相關；臨床分期從Ⅰ-Ⅳ逐漸升高，NF-κB的表達從14.3%、25.0%、30.8%、50.0%逐漸增加，與臨床病理呈正相關。villin蛋白的表達與性別、年齡、WHO分型、浸潤深度(P=0.38)、遠處轉移、臨床分期無關。見表3。

表3 胃癌組織中NF-κB、villin蛋白的表達與臨床病理的關系

2.5胃癌組織中NF-κB、villin蛋白的表達與患者預后的關系 Kaplan-Meier 生存曲線顯示，NF-κB陰性和弱陽性(-/1+)表達存活時間最長，陽性表達(2+)存活時間其次，強陽性表達(3+)存活時間最短，隨著NF-κB表達的陽性率增加，生存曲線越低，患者存活時間越短，表明NF-κB表達越高，患者預后情況越差。Villin蛋白的陰性和弱陽性(-/1+)表達存活時間最長，陽性表達(2+)存活時間其次，強陽性表達(3+)存活時間最短，隨著NF-κB表達的陽性率增加，生存曲線越低，患者存活時間越短，表明villin蛋白表達越高，患者預后情況越差。

圖3 NF-κB、villin蛋白的表達與患者預后的比較

2.6相關性分析 單因素分析發現，N分期、NF-κB和villin蛋白的表達水平可能是患者預后不良的危險因素；多因素分析發現，N分期、NF-κB和villin蛋白的表達水平也是患者預后不良的獨立危險因素。見表4。

表4 胃癌患者預后危險因素的的單因素及多因素分析

3 討 論

胃癌是全球死亡的三大原因之一，約占人類消化系統癌癥死亡總數的12%。在我國胃癌嚴重影響患者的生活質量，具有較高的發病率和死亡率。胃癌主要由幽門螺桿菌感染引起[5]，其他胃癌病例中的原因被認為是遺傳和地理因素。胃癌可以轉移到身體的其他部位，包括肝臟，骨骼和淋巴結在內，這使得診斷為晚期腫瘤的患者難以治愈，且總體生存率低。

Villin蛋白是一種鈣調節的肌動蛋白結合蛋白，可調節肌動蛋白絲的結構和組裝。這與上皮細胞的微絨毛和末端網中的肌動蛋白細絲有關，它的表達傾向于與分化的極化細胞的發育相關，這些細胞包含刷狀邊緣和微絨毛內含物，并且可以由長期酸暴露誘導作為腸細胞的末端分化標記，Villin需要有足夠的數量才能產生成熟的刷狀邊緣[6]。在正常成人組織中，在小大腸黏膜、腎近端小管、肝內膽管、胰管及膽囊上皮等的上皮細胞中觀察到絨毛蛋白的表達[7]。有相關研究[8]報道了絨毛蛋白在腸腺的增殖干細胞中表達，就其病理學方面，在食管和慢性萎縮性胃炎中觀察到的腸上皮化生中誘導絨毛蛋白表達。 此外，還經常發現絨毛蛋白在人類腺癌中表達，尤其是腸源性腺癌。絨毛蛋白被認為是最重要的腸道分化之一標記[9]。本實驗結果顯示，villin蛋白在癌組織中的陽性表達率和蛋白表達顯著高于癌旁組織，但表達與性別、年齡、WHO分型、浸潤深度、遠處轉移、臨床分期無關；生存曲線表示，villin蛋白表達的高低對患者預后情況有重要意義。

核因子-κB (NF-κB)是各種炎癥反應中的關鍵轉錄因子，是疾病中炎性細胞產生的因子，例如痛風性關節炎[10]。NF-κB最常見的形式是異二聚體p65/p50，作為與IκBα的復合物存在于胞質溶膠中以保持為無活性狀態[11]。炎性刺激可以觸發IκB激酶(IKK)復合物的激活，反之激活的IKK誘導IκB磷酸化，然后泛素化并且隨后發生蛋白酶體介導的降解，IκB降解促進磷酸化p65的釋放和核轉位[12-13]。在細胞核中，p65與多種炎癥基因的啟動子區域結合，用于轉錄調控[14]。本實驗結果顯示，NF-κB在癌組織中的陽性表達率和蛋白表達顯著高于癌旁組織，NF-κB在胃癌組織上的表達與性別、年齡、WHO分型無關；與浸潤深度、有無腫瘤轉移、臨床病理分期相關。隨著浸潤深度逐漸加深，從T1-T4，NF-κB表達從0%增加至20.0%、50.0%，腫瘤存在遠處轉移的NF-κB表達(3/4，75.0%)比未轉移(16/32，50.0%)逐漸升高，臨床分期從Ⅰ-Ⅳ逐漸升高，NF-κB的表達從14.3%、25.0%、30.8%、50.0%逐漸增加，表明NF-κB表達與臨床病理相關指標呈正相關。生存分析結果顯示：NF-κB表達的高低對患者預后情況有重要意義。

綜上所述，NF-κB、villin蛋白的表達參與胃癌的發生發展過程，NF-κB的表達與臨床分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)、腫瘤浸潤深度及其有無轉移有關，NF-κB、villin蛋白的高表達也表明了患者預后情況不良。