NF-κB、villin蛋白的表達(dá)與胃癌臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性

張海梅 張嘉剛 易敏 楊世榮 馬苑寧

(青海省第五人民醫(yī)院，青海 西寧 810000)

胃癌(gastric cancer，GC)是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。綜合治療策略大大提高了患者的治療效果，但大多數(shù)胃癌患者的預(yù)后仍然較差[1]。相關(guān)研究[2]發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤大多由于長(zhǎng)期炎癥發(fā)展形成，Gagliani等人提出“炎癥—腫瘤”假說(shuō)，并作出相關(guān)研究。絨毛(villin)蛋白是一種鈣調(diào)節(jié)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在正常成人組織中，在小腸黏膜，腎近端小管，肝內(nèi)膽管，胰管，膽囊上皮等的上皮細(xì)胞中觀察到絨毛蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)[3]證明，絨毛蛋白被認(rèn)為是最重要的腸道分化之一標(biāo)記。本課題主要研究NF-κB、villin蛋白的表達(dá)與胃癌臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1臨床材料 從我院收集2015年1月至2018年12月接受胃癌根治性切除術(shù)患者的胃癌組織36例，及鄰近正常癌旁組織36例(對(duì)應(yīng)胃癌患者的正常組織)。同時(shí)選36例健康者為對(duì)照組進(jìn)行社會(huì)學(xué)人口特征的對(duì)比，見(jiàn)表1。TNM分期根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員(AJCC)第8版分期系統(tǒng)進(jìn)行分類[4]，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行匿名分析，研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

表1 社會(huì)學(xué)人口特征比較

1.2主要試劑 兔抗人NF-κB單克隆抗體，購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；鼠抗人villin單克隆抗體，購(gòu)于上海研生生化試劑有限公司；免疫組化試劑盒，購(gòu)于上海研生生化試劑有限公司。無(wú)水乙醇、二甲苯、DAB染色液、蘇木素復(fù)染液、PBS緩沖液、中性樹(shù)膠等。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)法 將石蠟包埋組織切片用于實(shí)驗(yàn)研究。組織切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中進(jìn)行脫蠟，之后放入無(wú)水乙醇、90%、80%、70%的酒精中進(jìn)行水化，沖洗凈后放入PBS緩沖液中浸洗3次，5 min/次，擦干后每片樣品滴加200 μL的一抗，4℃冰箱孵育過(guò)夜。取出后37℃恒溫復(fù)溫，PBS緩沖液洗凈，擦干后每片樣品滴加200 μL的二抗Envisioon，37℃恒溫孵育30 min，結(jié)束后，用PBS緩沖液洗凈擦干，將新配的DAB溶液對(duì)樣品進(jìn)行染色，顯色后洗凈，再用蘇木素復(fù)染液染色樣品2 min，清水洗凈再用過(guò)酸酒精酸化，放入清水中反藍(lán)，樣品依次放入70、80、90和無(wú)水乙醇中，各放置5 min，再放于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各5 min，37℃恒溫箱中烘干，采用中性樹(shù)膠封片。

1.3.2Western blotting檢測(cè) 使用RIPA緩沖液(Solarbio，R0010，Shanghai，China)和抑制劑混合物(Sigma，P8340-5ML，St.Louis，MO，USA)提取細(xì)胞和組織的總蛋白質(zhì)并測(cè)定通過(guò)BCA蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(SBJ-1001; Beyotime，SENBEIJIA Bio，NanJing，China)。加入上樣緩沖液以調(diào)節(jié)濃度。變性后，向每個(gè)樣品孔中加入20 μg。使用12%SDS /PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，然后在電泳和跨膜后用PVDF膜轉(zhuǎn)移相應(yīng)的蛋白質(zhì)，用脫脂乳密封2 h。將膜與抗β-actin(2146,1∶1000; Danvers，MA)一起孵育初級(jí)抗體。β-actin用作上樣對(duì)照。使用ECL化學(xué)發(fā)光著色劑(Haigene，M2301，Harbin，China)使條帶可視化。

1.4患者隨訪 對(duì)所有患者手術(shù)后進(jìn)行上門(mén)或者電話隨訪，時(shí)間間隔為：每?jī)蓚€(gè)月隨訪1次。對(duì)患者的術(shù)后主要癥狀、身體檢查、CT、PET-CT、及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)化驗(yàn)檢查進(jìn)行了解和統(tǒng)計(jì)。此次試驗(yàn)將隨訪截止時(shí)間設(shè)定至2019年8月，無(wú)失訪患者，隨訪率為100%。

2 結(jié) 果

2.1胃癌患者的臨床病理參數(shù) 胃癌患者的臨床病理參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 胃癌患者的臨床病理參數(shù)

2.2免疫組化表達(dá)情況 NF-κB、villin蛋白表達(dá)在組織中染為棕褐色，NF-κB在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)；villin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 NF-κB、villin蛋白表達(dá)的比較

2.3Western blotting表達(dá) NF-κB在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)； villin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 WB檢測(cè)NF-κB、villin蛋白表達(dá)的比較

2.4NF-κB、villin蛋白的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 結(jié)果顯示，NF-κB在胃癌組織上的表達(dá)與性別、年齡、WHO分型無(wú)關(guān)；與浸潤(rùn)深度、有無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床病理分期相關(guān)。隨著浸潤(rùn)深度逐漸加深，從T1-T4，NF-κB表達(dá)從0%增加至20.0%、50.0%，與臨床病理呈正相關(guān)；腫瘤存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NF-κB表達(dá)(3/4，75.0%)比未轉(zhuǎn)移(16/32，50.0%)逐漸升高，與臨床病理呈正相關(guān)；臨床分期從Ⅰ-Ⅳ逐漸升高，NF-κB的表達(dá)從14.3%、25.0%、30.8%、50.0%逐漸增加，與臨床病理呈正相關(guān)。villin蛋白的表達(dá)與性別、年齡、WHO分型、浸潤(rùn)深度(P=0.38)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期無(wú)關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 胃癌組織中NF-κB、villin蛋白的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

2.5胃癌組織中NF-κB、villin蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier 生存曲線顯示，NF-κB陰性和弱陽(yáng)性(-/1+)表達(dá)存活時(shí)間最長(zhǎng)，陽(yáng)性表達(dá)(2+)存活時(shí)間其次，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(3+)存活時(shí)間最短，隨著NF-κB表達(dá)的陽(yáng)性率增加，生存曲線越低，患者存活時(shí)間越短，表明NF-κB表達(dá)越高，患者預(yù)后情況越差。Villin蛋白的陰性和弱陽(yáng)性(-/1+)表達(dá)存活時(shí)間最長(zhǎng)，陽(yáng)性表達(dá)(2+)存活時(shí)間其次，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(3+)存活時(shí)間最短，隨著NF-κB表達(dá)的陽(yáng)性率增加，生存曲線越低，患者存活時(shí)間越短，表明villin蛋白表達(dá)越高，患者預(yù)后情況越差。

圖3 NF-κB、villin蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后的比較

2.6相關(guān)性分析 單因素分析發(fā)現(xiàn)，N分期、NF-κB和villin蛋白的表達(dá)水平可能是患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素；多因素分析發(fā)現(xiàn)，N分期、NF-κB和villin蛋白的表達(dá)水平也是患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 胃癌患者預(yù)后危險(xiǎn)因素的的單因素及多因素分析

3 討 論

胃癌是全球死亡的三大原因之一，約占人類消化系統(tǒng)癌癥死亡總數(shù)的12%。在我國(guó)胃癌嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，具有較高的發(fā)病率和死亡率。胃癌主要由幽門(mén)螺桿菌感染引起[5]，其他胃癌病例中的原因被認(rèn)為是遺傳和地理因素。胃癌可以轉(zhuǎn)移到身體的其他部位，包括肝臟，骨骼和淋巴結(jié)在內(nèi)，這使得診斷為晚期腫瘤的患者難以治愈，且總體生存率低。

Villin蛋白是一種鈣調(diào)節(jié)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，可調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)構(gòu)和組裝。這與上皮細(xì)胞的微絨毛和末端網(wǎng)中的肌動(dòng)蛋白細(xì)絲有關(guān)，它的表達(dá)傾向于與分化的極化細(xì)胞的發(fā)育相關(guān)，這些細(xì)胞包含刷狀邊緣和微絨毛內(nèi)含物，并且可以由長(zhǎng)期酸暴露誘導(dǎo)作為腸細(xì)胞的末端分化標(biāo)記，Villin需要有足夠的數(shù)量才能產(chǎn)生成熟的刷狀邊緣[6]。在正常成人組織中，在小大腸黏膜、腎近端小管、肝內(nèi)膽管、胰管及膽囊上皮等的上皮細(xì)胞中觀察到絨毛蛋白的表達(dá)[7]。有相關(guān)研究[8]報(bào)道了絨毛蛋白在腸腺的增殖干細(xì)胞中表達(dá)，就其病理學(xué)方面，在食管和慢性萎縮性胃炎中觀察到的腸上皮化生中誘導(dǎo)絨毛蛋白表達(dá)。 此外，還經(jīng)常發(fā)現(xiàn)絨毛蛋白在人類腺癌中表達(dá)，尤其是腸源性腺癌。絨毛蛋白被認(rèn)為是最重要的腸道分化之一標(biāo)記[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，villin蛋白在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率和蛋白表達(dá)顯著高于癌旁組織，但表達(dá)與性別、年齡、WHO分型、浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期無(wú)關(guān)；生存曲線表示，villin蛋白表達(dá)的高低對(duì)患者預(yù)后情況有重要意義。

核因子-κB (NF-κB)是各種炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是疾病中炎性細(xì)胞產(chǎn)生的因子，例如痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[10]。NF-κB最常見(jiàn)的形式是異二聚體p65/p50，作為與IκBα的復(fù)合物存在于胞質(zhì)溶膠中以保持為無(wú)活性狀態(tài)[11]。炎性刺激可以觸發(fā)IκB激酶(IKK)復(fù)合物的激活，反之激活的IKK誘導(dǎo)IκB磷酸化，然后泛素化并且隨后發(fā)生蛋白酶體介導(dǎo)的降解，IκB降解促進(jìn)磷酸化p65的釋放和核轉(zhuǎn)位[12-13]。在細(xì)胞核中，p65與多種炎癥基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NF-κB在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率和蛋白表達(dá)顯著高于癌旁組織，NF-κB在胃癌組織上的表達(dá)與性別、年齡、WHO分型無(wú)關(guān)；與浸潤(rùn)深度、有無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床病理分期相關(guān)。隨著浸潤(rùn)深度逐漸加深，從T1-T4，NF-κB表達(dá)從0%增加至20.0%、50.0%，腫瘤存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NF-κB表達(dá)(3/4，75.0%)比未轉(zhuǎn)移(16/32，50.0%)逐漸升高，臨床分期從Ⅰ-Ⅳ逐漸升高，NF-κB的表達(dá)從14.3%、25.0%、30.8%、50.0%逐漸增加，表明NF-κB表達(dá)與臨床病理相關(guān)指標(biāo)呈正相關(guān)。生存分析結(jié)果顯示：NF-κB表達(dá)的高低對(duì)患者預(yù)后情況有重要意義。

綜上所述，NF-κB、villin蛋白的表達(dá)參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，NF-κB的表達(dá)與臨床分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)、腫瘤浸潤(rùn)深度及其有無(wú)轉(zhuǎn)移有關(guān)，NF-κB、villin蛋白的高表達(dá)也表明了患者預(yù)后情況不良。