白果內酯激活Nrf2/HO-1通路抑制星形膠質細胞的氧化應激緩解CPZ誘導的髓鞘脫失①

鞠文媛 陳陽陽 褚果果 李曉慧 張海飛 宋麗娟 王青 尉杰忠 肖保國 馬存根

（山西中醫藥大學神經生物學研究中心，國家中醫藥管理局多發性硬化益氣活血重點研究室，晉中 030619）

星形膠質細胞是大腦中最大的膠質細胞群體，中樞一旦受損，星形膠質細胞迅速被激活，修復受損組織，恢復神經功能［1］。同時，星形膠質細胞作為血腦屏障后的第一類實質細胞，是抵抗外源性氧化損傷的第一道防線，有其自身的抗氧化防御系統。高活性的抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶（glutathi?one peroxidase，GSH-Px）、過 氧 化 氫 酶（catalase，CAT）和超氧化 物 歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1

（nuclear factor erythroid-2-related factor 2/heme oxy?genase 1，Nrf2/HO-1）抗氧化通路等共同抵抗氧化損傷［2］。但在中樞神經系統（central nervous system，CNS）變性疾病中，持續的致病因素的刺激，使得星形膠質細胞的抗氧化體系失控，造成氧化產物釋放增多，抗氧化酶的表達降低［3］。所以在該類疾病中，調控星形膠質細胞的抗氧化體系，對于治療疾病是一種重要的策略。

白果內酯（bilobalide，BB）是從銀杏葉中提取出的一種倍半萜內酯，本課題組既往的研究顯示其可緩解雙環己酮草酰二腙（cuprizone，CPZ）誘導的髓鞘脫失，同時發現BB對CPZ模型病灶區的星形膠質細胞的數量和形態有明顯的影響，但是否有抗氧化機制參與并不清楚［4］。另外，有報道在缺血/再灌注模型中，BB可通過對抗缺血/再灌注誘導的氧化應激反應而發揮神經保護作用［5］。基于氧化應激在髓鞘脫失中的重要作用，本研究初步探索了BB對CPZ誘導的脫髓鞘模型中星形膠質細胞氧化應激的影響和作用機制，以期為進一步的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物10~12周齡的C57BL/6雄性小鼠共24只，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。實驗經山西中醫藥大學倫理委員會批準。動物在清潔級動物房進行適應性喂養1周后，再進行實驗。

1.1.2 試劑與儀器BB（中國南京道斯夫生物科技有限公司）；CPZ（美國Sigma公司）；脂多糖（lipo?polysaccharide，LPS）（中國北京索萊寶科技有限公司）；氧化和抗氧化試劑盒（中國上海泛柯實業有限公司）；抗體如anti-GFAP（美國Abcam）；anti-Nrf2（美國Cell signaling technology）；anti-HO-1（中國愛必信）；DAPI溶液（中國北京索萊寶科技有限公司）；TRITC標記的山羊抗兔IgG二抗（美國Jackson immunoResearch）；Alex Flour 488標記的驢抗雞IgG二抗（美國Jackson immunoResearch）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（中國武漢博士德生物工程有限公司）；熒光顯微鏡（美國Leica）；冷凍切片機（德國Leica）。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥24只小鼠按照體質量隨機分為正常組、模型組和BB治療組，每組8只。在飼料粉末中混入0.2%的CPZ制成CPZ飼料。模型組和BB治療組每天喂食CPZ飼料，正常組喂養正常飼料，共6周。BB治療組從喂食CPZ飼料的第4周末開始，每天腹腔注射BB 40 mg/（kg·d）1次，200 μl/只，持續給藥到第6周末，共2周。正常對照組和模型組每天持續腹腔注射等量的生理鹽水2周。

1.2.2 組織制備小鼠用10%水合氯醛麻醉完全后，解剖胸部，暴露心臟，每組隨機選取4只，用生理鹽水進行心臟灌注后，再用4%多聚甲醛進行心臟灌注，固定完全后取出完整的腦組織，4%多聚甲醛4℃固定2 h，蔗糖梯度脫水，OCT包埋腦組織，制成10 μm的冷凍切片，用于組織的免疫熒光染色。每組中剩下的4只，用生理鹽水進行心臟灌注后，冰上取出腦組織，置于玻璃研磨器中，并按照每20 mg組織加入150 μl的比例加入組織裂解液進行研磨，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，即為各組腦蛋白提取液，-80℃冰箱保存。

1.2.3 盧卡斯快藍染色檢測胼胝體區域髓鞘脫失情況將腦切片放入提前配好的固藍染液中，56℃浸泡過夜。次日，95%乙醇和去離子水洗滌，以去除多余的固藍染液，碳酸鋰溶液、75%乙醇溶液和去離子水中反復浸洗，直到能夠明顯區分灰質和白質。最后，置于梯度乙醇溶液中進行脫水，二甲苯中透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并收集圖片，Image-ProPlus6.0計算胼胝體區域的累積光密度。

1.2.4 免疫熒光染色檢測腦組織中Nrf2和HO-1的表達腦組織切片從-80℃冰箱取出，室溫中靜置片刻，置于4%多聚甲醛固定20 min。PBS淋洗，1%BSA封 閉1 h，加入 一 抗anti-GFAP、anti-Nrf2、anti-HO-1，4℃冰箱過夜。次日，PBS淋洗后，加入相應的二抗，室溫孵育2 h，PBS淋洗，加入DAPI溶液染10 min，PBS淋洗，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，Image-ProPlus6.0軟件分析結果。

1.2.5 原代星形膠質細胞的制備新生的C57BL/6小鼠（24 h內出生）若干，75%的乙醇消毒皮膚，無菌超凈臺中斷頭，分離出大腦皮層，放于DMEM基礎培養液中，用吸管反復吹打，制成細胞懸液。4℃、3 000 r/min離心10 min，棄掉上清，細胞沉淀重懸于DMEM完全培養液（10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液）中，濾網過濾后，用吸管吹打成單細胞懸液，置于75 cm2培養瓶，在37℃、5%CO2培養箱中培養。第2天更換DMEM完全培養液，培養至第7天，待細胞生長密度達到90%時，置于搖床上，180 r/min持續搖晃12 h，去除小膠質細胞，以達到純化星形膠質細胞的目的。以上過程重復2~3次。

1.2.6 氧化和抗氧化指標檢測收集各組細胞培養上清液，3 000 r/min，離心15 min，取上清液備用。各組腦蛋白提取液，用BCA法定量至相同的蛋白濃度。參照氧化和抗氧化試劑盒說明書檢測相關氧化指標如活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮（reactive nitrogen species，RNS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和抗氧化指標如CAT、GSH-Px和SOD水平。

1.2.7 Western blot檢測原代星形膠質細胞Nrf2和HO-1的表達各組細胞蛋白提取液，按每40 μl的蛋白樣本加入10 μl的5×loading Buffer后，沸水煮10 min。根據檢測指標的蛋白分子量制膠，進行SDS-PAGE凝膠電泳，后轉到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后，用TBST稀釋一抗Nrf2（1∶500）和HO-1（1∶300），加入到PVDF膜上，4℃過夜。次日，TBST洗去膜上多余的一抗，加入相對應的二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗，加入ECL顯色液進行顯色、拍照。Image J計算每組的灰度值。

1.3 統計學分析應用Graph Pad8.0軟件進行統計分析，實驗數據符合正態分布用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較選用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BB改善了CPZ小鼠的行為學和髓鞘脫失對小鼠進行高架十字迷宮和T迷宮測試，以檢測小鼠的焦慮狀態和學習能力。如圖1所示，高架十字迷宮結果顯示，與正常組相比，CPZ組小鼠進入開放臂的次數減少（P<0.001）。與CPZ組相比，BB治療組小鼠進入開放臂的次數增多（P<0.05）。T迷宮測試結果顯示，與正常組相比，CPZ組小鼠在食物臂的運動距離明顯縮短（P<0.001）。與CPZ組相比，BB治療組小鼠在食物臂的運動距離增長（P<0.05）。以上結果表明，BB用藥后改善了小鼠的焦慮情緒，提高了學習能力。盧卡斯快藍染色結果顯示，與正常組相比，CPZ組胼胝體區域的髓鞘脫失嚴重（P<0.01），與CPZ組相比，BB用藥組減輕了胼胝體區域的髓鞘脫失（P<0.01）。

圖1 各組小鼠的行為學測試和病理學染色（×50）Fig.1 Behavioral test and pathological staining of mice in each group（×50）

2.2 BB抑制CPZ小鼠氧化應激如圖2所示，體內實驗結果表明，與正常組相比，CPZ組腦組織中ROS、RNS和MDA等氧化產物的含量增加（P<0.01或P<0.05）；CAT、GSH-Px和SOD等抗氧化酶的含量減少（P<0.01或P<0.001）。與CPZ組相比，BB干預后顯著下調了小鼠腦組織中氧化產物ROS、RNS和MDA水平（P<0.05），上調了抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD水平（P<0.05）。

圖2 BB對CPZ小鼠氧化應激的影響Fig.2 Effects of BB on oxidative stress in CPZ mice

2.3 BB激活CPZ小鼠Nrf2/HO-1信號通路為探究星形膠質細胞是否參與CPZ小鼠腦內的抗氧化過程，小鼠腦片的星形膠質細胞和Nrf2/HO-1抗氧化通路進行免疫熒光染色。如圖3所示，與正常組相比，CPZ組小鼠腦內GFAP+Nrf2+/HO-1+的細胞表達增多，并出現Nrf2核轉移的情況（P<0.01或P<0.001），表明在氧化應激下，激活了Nrf2/HO-1抗氧化通路。與CPZ組相比，BB用藥組小鼠腦內GFAP+Nrf2+/HO-1+細胞表達進一步增多，并且出現Nrf2核轉移的星形膠質細胞表達增多（P<0.01），表明BB治療后可進一步激活腦內Nrf2/HO-1抗氧化通路，并且星形膠質細胞參與到CPZ小鼠體內的抗氧化過程。

圖3 BB對CPZ小鼠Nrf2/HO-1通路的影響（×100）Fig.3 Effect of BB on Nrf2/HO-1 pathway in CPZ mice（×100）

2.4 BB抑制LPS刺激的原代星形膠質細胞的氧化應激如圖4所示，與正常組相比，LPS組的星形膠質細胞分泌的ROS、RNS和MDA氧化產物增多（P<0.01或P<0.001），分泌的CAT、GSH-Px和SOD抗氧化酶減少（P<0.01或P<0.001）。與LPS組相比，BB用藥組顯著下調了星形膠質細胞的ROS、RNS和MDA水平（P<0.05或P<0.01），上調了原代星形膠質細胞抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD水平（P<0.05）。

圖4 BB對原代星形膠質細胞氧化應激的影響Fig.4 Effect of BB on oxidative stress of primary astrocytes

2.5 BB增加LPS刺激的原代星形膠質細胞Nrf2和HO-1蛋白表達如圖5所示，與正常組相比，LPS組中原代星形膠質細胞中Nrf2/HO-1的表達增加（P<0.05）；與LPS組相比，BB用藥組中原代星形膠質細胞中Nrf2和HO-1蛋白表達顯著增加（P<0.01或P<0.001）。

圖5 各組原代星形膠質細胞中Nrf2和HO-1蛋白表達Fig.5 Expressions of Nrf2 and HO-1 protein in primary astrocytes of each group

3 討論

實驗結果證實了BB具有良好的抗氧化作用，可以通過抑制星形膠質細胞的氧化應激反應緩解髓鞘脫失。在CPZ小鼠模型中，BB可抑制腦組織中ROS、RNS和MDA氧化產物的產生，上調抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD的水平，并且激活腦內的Nrf2/HO-1抗氧化通路。在星形膠質細胞的體外模型中，BB用藥后抑制了氧化產物ROS、RNS和MDA的產生，增加抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD的表達，并且促進了原代星形膠質細胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達，表明BB的抗氧化作用可能與其促進星形膠質細胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達有關。

星形膠質細胞的異常活化是多發性硬化（multiple slerosis，MS）等CNS炎癥變性疾病的主要病理標志之一［6］。在該類疾病中，大多都存在星形膠質細胞功能障礙和抗氧化系統的紊亂，造成神經元死亡等，這可能是其重要的發病機制［7-8］。所以，靶向星形膠質細胞成為當前治療CNS炎癥變性疾病的研究熱點。本實驗中，本課題組重點關注了星形膠質細胞的氧化應激，通過減輕星形膠質細胞的氧化損傷，達到了保護髓鞘的目的。BB是從銀杏葉中提取出的一種安全有效的活性單體［9］，文獻報道了BB對于神經系統的保護作用［10-11］。另外，文獻對BB是否能夠通過血腦屏障進行了論述，在體外實驗中使用血腦屏障滲透率的模型檢測了BB的血腦屏障透過率，體內實驗中使用大鼠模型評估了BB的腦內分布，結果發現BB可以較好地通過血腦屏障［12］。在之前的研究中發現，BB具有很好的抗氧化的作用，但是沒有關于BB在靶向星形膠質細胞緩解髓鞘脫失方面的研究。

氧化損傷在多種CNS疾病中起關鍵作用［13］。ROS和RNS的過量產生會導致線粒體功能障礙和細胞死亡［14］，研究發現在MS等疾病患者的腦內，氧化應激導致ROS等氧化產物增多，與膠質細胞異常活化和神經元損傷有很大的關系［15-16］。因此，減輕氧化應激是治療和預防MS等神經炎癥變性疾病的潛在策略。在機體的抗氧化防御體系中，CAT、GSH-Px和SOD是最常見的抗氧化酶，也是清除ROS、RNS和MDA等氧化產物的重要指標［17］。SOD是活性氧損傷的第一道防線，可降低過高濃度的活性氧物質，并把他們分解為危害較小的過氧化氫和水，保護細胞免受損傷［18］。CAT則通過將過氧化氫分解水和氧分子，進一步對抗氧化損傷［19］。GSH-Px是一種體內抵抗氧化應激過程中重要的過氧化物分解酶，通過把有毒的氧化產物谷胱甘肽催化為無毒的氧化型谷胱甘肽，從而保護細胞免受氧化物的損傷［20］。本研究發現，BB可增加星形膠質細胞中這些抗氧化酶的表達，其機制可能與激活Nrf2/HO-1抗氧化通路有關。抗氧化的信號通路有很多種，Nrf2/HO-1信號通路是其中一條重要的通路［21］。Nrf2是抗氧化反應中不可或缺的調控因子，在正常情況下，其活性被抑制，kelch樣ech相關蛋白1（kelch-like ech-associated protein 1，Keap1）與Nrf2在細胞質中結合，這時Nrf2是處于未激活狀態；如果一直未激活，Nrf2會被泛素化進而被降解；在氧化應激狀態下，Nrf2被激活。Nrf2從Keap1中釋放，轉移至細胞核，激活下游抗氧化基因的表達，包括HO-1以及抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD［22-23］。本次研究表明，BB干預促進Nrf2向細胞核內的轉移，促進Nrf2下 游 基 因HO-1及 抗 氧 化 酶CAT、GSH-Px和SOD的表達。研究顯示，通過上調Nrf2和HO-1的表達來保護細胞損傷，對MS等疾病都有神經保護作用［24］。在臨床上，靶向Nrf2的藥物富馬酸二甲酯是治療進展型MS的高效藥物，與其可以透過血腦屏障、減少炎癥細胞遷移、減少細胞的氧化損傷有關，從而可降低患者的復發率［25］。而BB對星形細胞Nrf2/HO-1信號通路的作用，為其治療MS等脫髓鞘疾病提供了新的理論支持。

大量實驗研究提示氧化應激和脫髓鞘之間存在某種因果關系［25-27］。氧化應激是導致CPZ模型中發生脫髓鞘病變的主要原因之一。氧化應激可產生過多的氧自由基及其代謝產物，引發細胞脂質和線粒體損傷，導致髓鞘脫失。在疾病的早期階段，氧化應激是導致腦內脫髓鞘的主要病因，而隨著病情的發展，體內內環境的紊亂，使得體內氧化應激和脫髓鞘病變互為因果，使得病情進一步加重［28］。本課題組利用CPZ誘導的中樞脫髓鞘模型，發現BB干預可有效保護髓鞘脫失，誘導Nrf2/HO-1信號通路，從而增加抗氧化產物形成，抑制氧化應激反應，推測可能與髓鞘保護有關。在此基礎上，利用體外原代星形膠質細胞，驗證了BB干預可誘導星形膠質細胞Nrf2/HO-1信號分子表達，從而增加抗氧化產物形成，抑制氧化應激反應。基于前人研究和本文的結果，本課題組推測BB干預緩解髓鞘脫失，可能與促進星形膠質細胞Nrf2/HO-1信號通路，產生抗氧化產物，抑制氧化應激有關。但鑒于星形膠質細胞氧化應激與脫髓鞘之間的重要關系，下一步將進行深入的探討。

綜上所述，本實驗表明，BB可以抑制星形膠質細胞的氧化應激反應，可能通過激活Nrf2/HO-1抗氧化通路發揮髓鞘保護作用，為下一步深入的研究奠定了基礎。