溫膽湯方劑對睡眠剝奪小鼠氧化應激及炎癥反應的影響

李莉 劉茹 何晶 陳云 郭娟 陳紅 劉玲

（湖北省中醫院，湖北省中醫藥研究院，湖北中醫藥大學附屬醫院，武漢 430074）

失眠是一種嚴重的公共衛生問題，其患病率較高，約30%以上的人口患有失眠癥狀，約10%的人口符合睡眠障礙的標準［1］。失眠癥是全球神經精神障礙的十大原因之一，而且有負面影響的后遺癥，譬如日間疲勞、認知困難、情緒調節受損和生活質量下降，嚴重影響公眾健康，但人們對失眠癥的潛在病理生理學或失眠影響身心健康的機制知之甚少［2］，這便給失眠的有效治療帶來了很大障礙。失眠在中醫學屬于“不寐”“不得臥”“不得眠”的范疇［3］，常見的中醫治療方法包括中藥湯劑、推拿、針灸、火罐、刺血等，相較于西藥的單靶點機制，中藥治療具有多靶點、多途徑改善失眠癥狀的優勢［4］。溫膽湯為中醫學經典方劑之一，具有理氣化痰、利膽合胃的功效，溫膽湯在失眠的臨床治療上具有較好效果，值得推廣［5］。然而，關于溫膽湯治療失眠的具體分子機制尚未完全闡明。吳蕾［6］研究結果顯示，溫膽湯可減緩人臍靜脈內皮細胞損傷中的氧化應激，改善炎癥損傷。而失眠與氧化應激、炎癥反應存在關聯［7-8］，故推測溫膽湯可能通過調控氧化應激和炎癥損傷來改善失眠。本研究采用改良版水平轉盤睡眠剝奪法構建失眠小鼠模型［9］，采用溫膽湯進行治療，檢測小鼠氧化應激水平以及炎癥細胞因子水平變化，以期闡明溫膽湯治療失眠的可能機制，為中醫藥治療失眠提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物30只SPF級昆明種雌性小鼠，4~5周齡，體質量為（20±2）g，購自三峽大學實驗動物中心。

1.1.2 溫膽湯方劑6 g半夏（批號：19021091）、6 g竹茹（批號：18122371）、6 g麩炒枳實（批號：19031361）、9 g陳皮（批號：19051171）、3 g炙甘草（批號：19040261）、4.5 g茯苓（批號：19061131），每劑含生藥34.5 g，均由湖北省中醫院門診中藥房提供。一煎，藥材8倍水煎制，沸騰后煎40 min，過濾取汁；二煎，6倍水煎制，沸后煎30 min，過濾取汁，2次汁液混合后，濃縮成1∶1藥液備用。

1.1.3 主要試劑艾司唑侖片購自襄陽市華中藥業股份有限公司；DMEM培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定試劑盒及丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒、兔抗核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）抗體、羊抗兔IgG抗體均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；兔抗p-NF-κB抗體購自美國CST公司；RIPA（強）組織細胞快速裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 睡眠剝奪小鼠構建通過改良版水平轉盤睡眠剝奪法構建失眠小鼠模型。使用亞克力塑料板構建睡眠剝奪箱（長：110 cm、寬：60 cm、高：40 cm），其底部固定有15個圓柱形平臺（直徑：6.5 cm、高：8 cm），保持10 cm縱向間距，13 cm橫向間距，注入23~25℃水至平臺下1 cm處，保持水溫。適應性培養7 d后，將24只待造模小鼠放置于睡眠箱平臺上進行站立訓練，當其即將進入睡眠時，由于肌肉松弛垂頭觸水或落入水中而驚醒，使其被迫保持清醒站立，早晚各拿出休息1次，每次30 min，訓練2周。造模期間，每2 d記錄1次小鼠行為學改變（精神狀態、飲食）、毛發和體質量。

1.2.2 分組與處理30只SPF級昆明種雌性小鼠隨機挑選6只作為對照組，剩余24只構建睡眠剝奪模型，并隨機分為4組：模型組、溫膽湯低濃度組（含生藥0.5 g/ml）、溫膽湯高濃度組（含生藥2 g/ml）、艾司唑侖片組（0.15 mg/kg），每組6只。于模型構建的第8天開始灌胃，1次/d，共7 d，低、高劑量組及艾司唑侖片組分別灌入0.5 ml相應濃度的溫膽湯劑或艾司唑侖片溶液，對照組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃。最后1次給藥干預12 h后，眼眶采血0.5~1 ml，離心制備血清。100 mg/kg戊巴比妥鈉過量麻醉處死小鼠，收集小鼠腦組織，于-80℃冰箱保存。

1.2.3 流式檢測小鼠腦組織ROS水平取出小鼠腦組織，用含5%雙抗的PBS漂洗3次，置于200目細胞篩中，用玻璃杯輕輕研磨腦組織，研碎后用DMEM沖洗，經過細胞篩獲得細胞懸液。吸管吹打細胞懸液后，175 g離心5 min，棄上清，重復清洗2次，PBS重懸細胞后備用。收集細胞，按照1∶1 000用無血清培養基稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L重懸細胞，將細胞濃度調整為1×106個/ml，于5%CO2、37℃細胞恒溫培養箱內孵育，為使探針和細胞充分接觸，每隔3~5 min顛倒混勻1次。孵育20 min后，無血清培養基洗滌細胞去除多余的DCFH-DA，重復3次。收集各組細胞，上機檢測，NovoCyte分析軟件對其進行分析。

1.2.4 生化檢測小鼠血清和腦組織GSH-PX、SOD、MPO活性及GSH、MDA濃度根據試劑盒說明書，分別檢測小鼠血清和腦組織中GSH-PX、SOD、MPO活性及GSH、MDA濃度。

1.2.5 ELISA檢測小鼠血清和腦組織IL-6、TNF-α及IL-1β濃度根據ELISA試劑盒說明書，分別檢測小鼠血清和腦組織中炎癥因子IL-6、TNF-α及IL-1β濃度。

1.2.6 Western blot檢 測 小 鼠 腦 組 織NF-κB及p-NF-κB蛋白表達將腦組織剪碎，置于冰上使用裂解液裂解，4℃、12000 g離心15 min，吸取上清液獲取總蛋白。根據BCA定量結果上樣，12% SDSPAGE凝膠電泳，轉膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶4℃封閉過夜，加入1∶1000稀釋后一抗（NF-κB、p-NFκB、GAPDH），室溫孵育1 h后，PBS洗滌3次，每次5 min。加入1∶20 000稀釋后HRP標記的二抗，室溫孵育1 h后，PBS洗滌3次，每次5 min。曝光顯影，并進行灰度值分析。

1.3 統計學分析實驗數據采用SPSS22.0統計軟件進行分析，計量數據以±s表示，采用單因素方差分析法進行多組間差異分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 溫膽湯方劑改善失眠小鼠一般癥狀與對照組相比，模型組小鼠精神狀態及毛發較差，飲食量減少，體質量顯著下降（P<0.05）；與模型組相比，溫膽湯低、高濃度組及艾司唑侖片組小鼠以上癥狀有所改善，體質量顯著增加（P<0.05），且高劑量組體質量改善情況顯著高于低劑量組（P<0.05），見圖1。

圖1 小鼠處死前體質量比較Fig.1 Comparison of mice weight before death

2.2 溫膽湯方劑降低失眠小鼠腦組織中ROS水平模型組小鼠腦組織ROS水平較對照組顯著升高（P<0.05）。相較于模型組小鼠，溫膽湯低、高濃度組及艾司唑侖片組小鼠腦組織ROS水平明顯降低（P<0.05），且溫膽湯高濃度組降低效果顯著高于低劑量組（P<0.05），見圖2。

圖2 小鼠腦組織ROS水平Fig.2 ROS levels in brain tissues of mice

2.3 溫膽湯方劑緩解失眠小鼠氧化應激與對照組相比，模型組小鼠血清和腦組織中GSH-PX、SOD和GSH酶活顯著降低（P<0.05），MPO及MDA濃度均顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，溫膽湯低、高濃度組及艾司唑侖片組小鼠血清和腦組織中GSHPX、SOD和GSH酶活顯著升高（P<0.05），MPO及MDA濃度顯著降低（P<0.05），見表1、表2。

表1 小鼠血清中氧化應激因子水平（±s）Tab.1 Levels of oxidative stress factors in serum of mice（±s）

表1 小鼠血清中氧化應激因子水平（±s）Tab.1 Levels of oxidative stress factors in serum of mice（±s）

Note：1）P<0.05 vs control；2）P<0.05 vs model；3）P<0.05 vs L-density.

Groups Control Model L-density H-density Estazolam tablets GSH-PX/（U·ml-1）194.70±14.29 123.03±6.021）151.40±4.092）167.27±7.642）3）172.24±2.292）3）SOD/（U·ml-1）111.88±13.22 25.38±4.491）40.24±3.032）68.17±1.952）3）70.78±3.672）3）GSH/（μmol·L-1）64.04±2.05 20.46±1.971）35.27±3.192）41.94±1.692）3）49.56±1.122）3）MPO/（U·L-1）13.40±0.70 39.31±2.741）29.52±2.292）23.18±1.492）3）20.09±0.672）3）MDA/（nmol·ml-1）20.72±1.82 84.44±2.251）67.11±5.822）56.30±2.392）3）53.53±2.932）3）

表2 小鼠腦組織中氧化應激因子水平（±s）Tab.2 Levels of oxidative stress factors in brain tissues of mice（±s）

表2 小鼠腦組織中氧化應激因子水平（±s）Tab.2 Levels of oxidative stress factors in brain tissues of mice（±s）

Note：1）P<0.05 vs control；2）P<0.05 vs model；3）P<0.05 vs L-density.

Groups Control Model L-density H-density Estazolam tablets GSH-PX/（U·mgprot-1）193.79±9.81 119.04±2.391）151.68±5.952）164.70±4.342）3）174.48±2.732）3）SOD/（U·mgprot-1）117.13±8.33 26.90±6.951）42.21±3.622）60.77±1.872）3）74.20±3.872）3）GSH/（μmol·gprot-1）67.69±3.88 20.56±1.071）36.53±1.182）42.27±3.282）3）53.89±2.572）3）MPO/（U·gwet weight-1）13.34±0.53 41.08±2.291）30.10±1.152）21.09±0.312）3）20.69±0.162）3）MDA/（nmol·mgprot-1）19.89±0.93 86.00±3.211）67.06±1.752）48.53±5.272）3）45.43±8.272）3）

2.4 溫膽湯方劑降低失眠小鼠炎癥細胞因子水平與對照組相比，失眠模型小鼠血清及腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β濃度顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，溫膽湯低、高濃度組及艾司唑侖片組小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β濃度顯著降低（P<0.05），且溫膽湯高濃度組和艾司唑侖片組效果更顯著（P<0.05），見圖3。

圖3 小鼠血清（A）及腦組織（B）炎癥因子濃度Fig.3 Concentration of inflammatory cytokines in serum（A）and brain tissue（B）of mice

2.5 溫膽湯方劑抑制失眠小鼠腦組織NF-κB蛋白磷酸化水平模型組小鼠腦組織p-NF-κB蛋白相對表達量較對照組顯著增加（P<0.05），溫膽湯及艾司唑侖片干預后小鼠腦組織中p-NF-κB蛋白相對表達量較模型組顯著降低（P<0.05），且隨溫膽湯濃度的增加，其相對表達量降低更為顯著（P<0.05），見圖4。

圖4 小鼠腦組織中p-NF-κB蛋白表達量Fig.4 Expression of p-NF-κB protein in brain tissue of mice

3 討論

失眠的治療方法主要分為2種，藥物治療和非藥物治療（包括認知行為治療和心理治療、替代治療方法），臨床上藥物干預多為唑吡坦、埃索匹克隆和扎萊普隆、褪黑激素等，但西藥干預會導致不良反應的發生［10］。中醫藥治療失眠療效顯著，對失眠發病過程的理解也十分獨到，引起失眠的病位包括心、肝、脾等，影響因素有瘀血、痰等，二陳湯、溫膽湯等則以化痰理氣為特點，在治療失眠上取得了較好的療效［11］。溫膽湯相較于臨床上常用的抗失眠藥物，作用溫和，無不良反應及耐藥性［12］。本研究采用溫膽湯治療睡眠剝奪小鼠，其毛發、飲食及體質量逐漸趨于正常，提示溫膽湯能改善睡眠剝奪引起的相關癥狀。

KOLESNIKOVA等［13］研究發現絕經后失眠婦女的脂質過氧化過程和抗氧化防御系統失衡，氧化應激反應明顯。王新源等［14］檢測失眠癥患者血清中GSH-PX、MDA、SOD等活性水平發現失眠癥患者氧化應激水平顯著高于健康人，提示氧化應激可能參與了失眠癥的發病過程。在本次研究中，睡眠剝奪小鼠腦組織ROS水平顯著升高，血清及腦組織中MPO及MDA濃度升高，GSH-PX、SOD和GSH酶活顯著降低，提示小鼠氧化應激嚴重，與上述研究結果一致。睡眠障礙會導致多種醫學問題，包括認知障礙、免疫功能下降、代謝失衡等［15］。臨床檢測發現失眠患者炎癥因子水平顯著高于正常對照者［16］。SU等［17］研究也顯示失眠剝奪大鼠腦內的TNF-α和IL-6水平顯著增加；本次研究結果與之一致，睡眠剝奪小鼠血清和腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高。失眠會導致與心腦血管疾病、糖尿病等慢性疾病相關的炎癥標志物增加，NF-κB作為炎癥反應的關鍵因子之一，也會出現表達量增多［18］。王甜甜［19］發現溫膽湯對胰島素抵抗大鼠的改善作用可能是通過減輕大鼠體內氧化應激水平，改善炎癥狀態來實現的。因此，推測溫膽湯可改善機體內的氧化應激及炎癥水平，但對于失眠是否有相應作用尚不可知，故本研究采用低、高濃度溫膽湯治療睡眠剝奪小鼠，檢測到小鼠血清及腦組織中MPO、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著低于模型組，腦組織中NF-κB磷酸化水平降低，GSH-PX、SOD和GSH酶活升高，提示溫膽湯可調理失眠小鼠體內的氧化應激及炎癥水平。

綜上所述，溫膽湯可明顯改善睡眠剝奪小鼠精神萎靡、體質量減輕等癥狀，其作用可能與降低小鼠氧化應激和炎癥水平有關。眾所周知，中藥具有多靶點、多途徑治療的特點，所以本文研究結果僅為溫膽湯治療失眠的部分作用，后續將從其他方面進行探討，希望能提供更多溫膽湯的藥理作用，為其臨床治療失眠奠定基礎。