蔓荊子黃素通過上調miR-1193表達調控胃癌細胞的增殖和凋亡①

鄧明 鄧芳 陳志堅

（廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣州 510405）

盡管胃癌的治療取得了重大進展，但其仍是全球最致命的癌癥之一。胃癌是一種局部性疾病，淋巴結轉移和血源性轉移是其易位的重要途徑［1-2］。化療是防止胃癌細胞侵襲和轉移的重要手段，然而由于嚴重的毒副作用、不良反應及耐藥性，胃癌患者生活質量較差、復發率高、五年存活率較低。近年來，從天然產物中尋找有效、安全的抗腫瘤藥物已成為研究的熱點。蔓荊子黃素（vitexicarpin）是從馬鞭草科植物單葉蔓荊果實中提取的一種多甲氧基黃酮，是蔓荊子的主要活性成分，一直被用于抗炎和癌癥治療［3］。現有研究表明，蔓荊子黃素通過抑制增殖、誘導周期阻滯和凋亡、抑制侵襲轉移在乳腺癌、結腸癌、食管癌等多種惡性腫瘤中發揮廣泛的抗癌藥理活性［4-6］。然而，蔓荊子黃素在胃癌中的作用和潛在分子機制并未完全闡明。微小RNA（miR）-1193是近年發現的抑癌基因，乳腺癌中miR-1193表達降低，上調miR-1193表達能夠降低癌細胞的增殖和遷移能力［7］。然而，miR-1193在胃癌中是否具有抑癌作用、蔓荊子黃素如何調控miR-1193發揮作用尚不明確。本研究通過探討蔓荊子黃素對胃癌細胞增殖、凋亡及miR-1193表達的影響，分析其可能的作用機制，以期為蔓荊子黃素用于防治胃癌提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌細胞AGS購自美國模式培養物保藏所；胎牛血清、青鏈霉素雙抗、RPMI1640培養基購自美國Hyclone公司；蔓荊子黃素（純度≥98%，批號：20190215）購自四川維克奇生物科技有限公司；miR-1193模擬物（miR-1193 mimics）、模擬物陰性對照（miR-NC）、miR-1193抑制物（anti-miR-1193）、抑制物陰性對照（anti-miR-NC）、PCR引物由廣州銳博生物公司提供；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物公司；miRNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、通用PCR Master Mix購自北京天根生化科技有限公司；細胞計數試劑盒（CCK-8）、細胞周期素D1（CyclinD1）兔單克隆抗體（批號：20190411）、p21兔單克隆抗體（批號：20190302）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）兔單克隆抗體（批號：20190111）、Bcl相關X蛋白（Bax）兔多克隆抗體（批號：20190408）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）兔多克隆抗體（批號：20190322）、羊抗兔IgG二抗（批號：20190228）購自上海碧云天生物科技研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組AGS細胞采用補充10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI1640培養基在37℃、5%CO2、濕度97%的培養箱中培養。當細胞70%融合時，胰酶消化，按照1∶3比例傳代，2 d換液1次。收集第3代對數期AGS細胞進行實驗。蔓荊子黃素用二甲基亞砜溶解，初始濃度為1.0×104μmol/L，-20℃保存備用，實驗時稀釋至所需濃度。用終濃度分別為10、20、40 μmol/L的蔓荊子黃素培養液孵育AGS細胞48 h，分別命名為蔓荊子黃素-低組、蔓荊子黃素-中組和蔓荊子黃素-高組。對照組用含同等濃度的二甲基亞砜孵育48 h。利用脂質體轉染法將miR-NC、miR-1193 mimics分別轉染至AGS細胞，分別命名為miR-NC組、miR-1193組。將anti-miR-NC、anti-miR-1193分 別轉 染 至AGS細胞，用終濃度為40 μmol/L的蔓荊子黃素培養液轉染細胞48 h，分別命名為蔓荊子黃素+anti-miR-NC組、蔓荊子黃素+anti-miR-1193組。

1.2.2 CCK-8法測定細胞活力將未轉染的AGS細胞接種于96孔板，貼壁后用含10、20、40 μmol/L蔓荊子黃素的培養液（100 μl/孔）培養箱孵育48 h［8］；將轉染miR-NC或miR-1193 mimics的AGS細胞接種于96孔板，培養48 h。將轉染anti-miR-NC或antimiR-1193的AGS細胞接于種96孔板，貼壁后用含40 μmol/L蔓荊子黃素的培養液（100 μl/孔）培養箱孵育48 h，設置3個復孔。每孔加入10 μl的CCK-8溶液，再培養2 h。酶標儀在450 nm處測量吸光度（A）值。增殖抑制率（%）=（1-A實驗組/A對照組）×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡收集各組AGS細胞，PBS洗滌1次。1 500 r/min離心5 min。將細胞重懸于500 μl 1×結合緩沖液中，加入5 μl Annexin VFITC和PI在室溫孵育30 min。流式細胞術檢測細胞總凋亡率。

1.2.4 Western blot檢測CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達放射緩沖液冰上裂解細胞，收集上清即為細胞蛋白。測定蛋白濃度后，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，并轉移至聚偏二氟乙烯膜。5%脫脂牛奶室溫封閉膜30 min，加入針對CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax和GAPDH的特異性一抗4℃孵育過夜。室溫下將膜與二抗孵育1 h。化學發光試劑盒檢測條帶信號，Image J軟件通過檢測各條帶光密度值分析目的蛋白表達水平。

1.2.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-1193表達試劑盒提取miRNA，反轉錄為cDNA后，采用通用PCR Master Mix和相應引物進行RT-qPCR，2-ΔΔCt法分 析miR-1193表 達水 平。miR-1193 F：5'-GCCGAGGCACTTCATTTA-3'，R：5'-CTCAACTGGT?GTCGTGGA-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3 統計學分析采用SPSS22.0軟件進行統計分析。數據以±s表示。采用獨立樣本t檢驗比較兩組間差異；采用單因素方差法比較多組間差異，進一步組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蔓荊子黃素對胃癌AGS細胞增殖的影響與對照組相比，蔓荊子黃素-低、中、高組AGS細胞增殖抑制率、p21蛋白表達顯著升高，CyclinD1蛋白表達顯著降低（P<0.05）。蔓荊子黃素-低、中、高3組間以上指標差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖1、表1。

表1 蔓荊子黃素對胃癌AGS細胞增殖的影響（xˉ±s，n=9）Tab.1 Effect of vitexicarpin on proliferation of gastric cancer AGS cells（xˉ±s，n=9）

圖1 增殖相關蛋白表達Fig.1 Expressions of proliferation-related proteins

2.2 蔓荊子黃素對胃癌AGS細胞凋亡的影響與對照組相比，蔓荊子黃素-低、中、高組AGS細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低（P<0.05）。蔓荊子黃素-低、中、高3組間以上指標差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2、表2。

表2 蔓荊子黃素對胃癌AGS細胞凋亡和凋亡相關蛋白表達的影響（xˉ±s，n=9）Tab.2 Effect of vitexicarpin on apoptosis and apoptosis related protein expressions of gastric cancer AGS cells（xˉ±s，n=9）

圖2 蔓荊子黃素對胃癌AGS細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of vitexicarpin on apoptosis of gastric cancer AGS cells

2.3 蔓荊子黃素對胃癌AGS細胞中miR-1193表達的影響與對照組相比，蔓荊子黃素-低、中、高組AGS細胞miR-1193表達顯著升高（P<0.05）。蔓荊子黃素-低、中、高3組間miR-1193表達差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 蔓荊子黃素對胃癌AGS細胞中miR-1193表達的影響（±s）Tab.3 Effect of vitexicarpin on expression of miR-1193 in gastric cancer AGS cells（±s）

表3 蔓荊子黃素對胃癌AGS細胞中miR-1193表達的影響（±s）Tab.3 Effect of vitexicarpin on expression of miR-1193 in gastric cancer AGS cells（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with Vitexi?carpin-L group，2）P<0.05；compared with Vitexicarpin-M group，3）P<0.05.

Groups Control Vitexicarpin-L Vitexicarpin-M Vitexicarpin-H F P n9 9 9 9 miR-1193 1.00±0.08 1.75±0.161）2.56±0.221）2）3.24±0.281）2）3）214.464<0.01

2.4 上調miR-1193對胃癌AGS細胞增殖和凋亡的影響與miR-NC組相比，miR-1193組AGS細 胞miR-1193表達、增殖抑制率、凋亡率、Bax和p21蛋白表達顯著升高，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達顯著降低（P<0.05）。見圖3、表4。

表4 miR-1193過表達對胃癌AGS細胞增殖和凋亡的影響（xˉ±s，n=9）Tab.4 Effect of miR-1193 overexpression on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells（xˉ±s，n=9）

圖3 上調miR-1193對胃癌AGS細胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-1193 up-regulation on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells

2.5 下調miR-1193逆轉了蔓荊子黃素（40 μmol/L）對胃癌AGS細胞增殖和凋亡的作用與蔓荊子黃素+anti-miR-NC組相比，蔓荊子黃素+anti-miR-1193組AGS細 胞miR-1193組AGS細胞miR-1193表達、細胞增殖抑制率、凋亡率、Bax和p21蛋白表達顯著降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達顯著升高（P<0.05）。見表5、圖4。

表5 下調miR-1193逆轉了蔓荊子黃素對胃癌AGS細胞增殖和凋亡的作用（±s，n=9）Tab.5 Down-regulation of miR-1193 reversed the effect of vitexicarpin on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells（±s，n=9）

表5 下調miR-1193逆轉了蔓荊子黃素對胃癌AGS細胞增殖和凋亡的作用（±s，n=9）Tab.5 Down-regulation of miR-1193 reversed the effect of vitexicarpin on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells（±s，n=9）

Note：Compared with Vitexicarpin+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Groups Vitexicarpin+anti-miR-NC Vitexicarpin+anti-miR-1193 t P miR-1193 1.00±0.07 0.57±0.041）16.000<0.01 Inhibition rate/%54.03±4.66 17.58±1.641）22.135<0.01 Apoptosis rate/%29.13±2.86 11.73±1.101）17.035<0.01 CyclinD1 protein 0.34±0.03 0.71±0.061）16.547<0.01 p21 protein 0.77±0.05 0.41±0.041）16.867<0.01 Bcl-2 protein 0.24±0.02 0.49±0.041）16.771<0.01 Bax protein 0.59±0.05 0.27±0.031）16.464<0.01

圖4 下調miR-1193逆轉了蔓荊子黃素對胃癌AGS細胞增殖和凋亡的作用Fig.4 Down-regulation of miR-1193 reversed the effect of vitexine on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells

3 討論

幾千年來，中草藥已被廣泛應用于各種疾病的治療，包括癌癥。蔓荊子黃素作為蔓荊子中主要黃酮類化學成分，具有明確的抗腫瘤特性，其通過調節原癌基因、抑癌基因表達和細胞內信號通路抑制癌細胞生長、侵襲和轉移，誘導細胞凋亡，具有腫瘤治療替代品潛力［9］。研究顯示，蔓荊子黃素可引起口腔癌、肺癌細胞形態學改變、DNA聚集和損傷，影響DNA修復進而抑制細胞存活并誘導細胞凋亡［10-11］。蔓荊子黃素通過抑制磷酸肌醇3激酶（PI3K）激活還可抑制鼻咽癌的進展［12］。此外，蔓荊子黃素還可抑制DNMT1活性、增加miR-148a-3p表達進而抑制肝癌細胞的干細胞特性［13］。本研究探討蔓荊子黃素在胃癌中的抗腫瘤作用顯示，蔓荊子黃素可顯著抑制AGS增殖，誘導細胞凋亡，并呈一定的量效關系，與XIE等［14］報道其在口腔鱗癌中抗增殖作用一致。p21是細胞周期調控過程中一種負性調節因子，其通過抑制CyclinD1/細胞周期素依賴激酶（CDK4）復合體的活性在阻礙細胞周期從G1到S期中發揮關鍵作用，是重要的抗增殖因子［15］。細胞凋亡是一個受多種因素調控的復雜過程，Bcl-2位于線粒體外膜，其通過抑制細胞色素C從線粒體的釋放來阻止細胞凋亡，而Bax具有相反作用，蔓荊子黃素通過下調CyclinD1、Bcl-2表達，上調Bax表達對膽管癌細胞具有顯著的增殖抑制和凋亡誘導作用［16］。本研究顯示，蔓荊子黃素呈劑量依賴效應降低CyclinD1、Bcl-2表達水平，升高p21和Bax表達水平，進一步證實蔓荊子黃素在胃癌中的抗增殖和促凋亡作用。

miRNA是一類長度為18~22個核苷酸的新型非編碼RNA分子，其通過負性調控下游基因表達在細胞生長、發育、代謝等多種生物學過程中發揮重要作用，其表達失衡與胃癌等腫瘤的發生有關［17］。miR-1193參與調控細胞增殖和遷移，其表達降低對皮膚鱗狀細胞癌、T細胞白血病發生具有促進作用［18-19］。本研究顯示，蔓荊子黃素可顯著升高AGS細胞中miR-1193的表達水平，提示蔓荊子黃素在胃癌中的抗腫瘤作用可能與上調miR-1193有關。分析miR-1193在AGS細胞中的作用發現，上調miR-1193可顯著降低AGS細胞的增殖能力，促進細胞凋亡。此外，下調miR-1193表達還可逆轉蔓荊子黃素對AGS細胞增殖和凋亡的影響。提示蔓荊子黃素對AGS細胞的增殖抑制和凋亡促進作用與上調miR-1193表達有關。

綜上所述，蔓荊子黃素能夠抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，其機制與上調miR-1193表達有關，這豐富了蔓荊子黃素的抗腫瘤機制，為蔓荊子黃素在胃癌防治中的應用提供了科學依據。