無血清全懸浮PK15細胞培養豬圓環病毒2型的研究

劉天倫

(北京民海生物科技有限公司，北京 102609)

豬圓環病毒病是由豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)引起的病毒性傳染病，給養豬業造成巨大損失。研究表明，PCV2僅在PK15等少數哺乳動物細胞上增殖，且由于PCV2感染后細胞不破裂，想要獲得高病毒滴度難度較大[1]。PCV2體外培養特性適于在具有旺盛增殖能力并處于有絲分裂過程中的細胞上復制，并且PCV2的復制依賴于細胞周期S期表達的各種細胞蛋白及酶[1]。D-氨基葡萄糖一方面可以增強細胞S期蛋白的表達，另一方面可以促進病毒DNA進入細胞核，因此，D-氨基葡萄糖處理細胞可顯著增強病毒的增殖能力[2]。

目前，應用PK15細胞進行PCV2的生產主要是采用轉瓶和微載體工藝。轉瓶存在占地空間大、勞動強度大等缺點。何錫忠等[3]利用微載體技術培養PK15細胞生產PCV2，許冬等[4]對片狀載體培養PCV2也進行了工藝的研究，但微載體工藝存在價格昂貴，球狀載體重復利用效果差，放大培養繁瑣等劣勢。馴化一株可適應大規模培養且無血清全懸浮培養PCV2的PK15細胞，勢必可推進工藝的進一步升級。本研究對一株貼壁的PK15細胞進行了無血清全懸浮馴化，然后進行了馴化后細胞對PCV2敏感性試驗，對接毒時間、接毒量以及收獲方式進行了試驗分析，以期為大規模培養PCV2提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和毒株 PK15細胞(豬圓環病毒1型陰性、豬肺炎支原體陰性)由大北農動物醫學研究中心保存，PCV2(DBN-SX07)由大北農動物醫學研究中心提供。

1.1.2 主要試劑和耗材 無血清懸浮培養基PK15-H(M20317)，上海源培生物有限公司；D-氨基葡萄糖(D-G)，Sigma公司；DMEM-F12(12500-096)，Gibco公司；新生牛血清(04-102-1A)，BI公司；Anti-PCV2-MAB 12c.48(圓環單克隆抗體)，韓國JBT公司；羊抗鼠熒光抗體購自美國KPL公司。細胞方瓶、搖瓶、96孔板購自美國康寧公司。

1.1.3 主要儀器和設備 CO2培養箱，Thermo公司；軌道式振蕩器購自杭州奧盛儀器有限公司；倒置顯微鏡，Olympus公司；Countstar細胞計數儀，上海睿鈺生物科技有限公司；低速冷凍離心機，美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 PK15細胞無血清全懸浮馴化 對一株貼壁的PK15細胞進行了無血清的全懸浮馴化，經貼壁降血清培養、低血清懸浮優化傳代、無血清懸浮傳代培養，累計傳代23次后，該株細胞可在無血清全懸浮培養條件下，初始密度為0.5×106/mL時，經72 h密度可增殖到4.0×106/mL左右，形態良好，倍增時間穩定，且細胞活率達到95%以上，命名為PK15-S[5]。

1.2.2 PK15-S細胞對PCV2敏感性實驗 參考平面PK15細胞接毒工藝，將馴化后的PK15-S細胞按0.04 MOI接毒，接毒密度為0.5×106/mL，同時加入2% D-G(V/V)，48 h、72 h收獲病毒，收獲后用間接免疫熒光法測定病毒滴度。

1.2.3 不同接毒時間對病毒滴度的影響 細胞初始密度0.5×106/mL，分別采用0 h接毒和24 h接毒的方式進行接毒實驗的摸索，按照0.04 MOI接毒的同時加入2% D-G(V/V)，兩種方法收獲時間分別為病毒培養的48 h和72 h，收獲后用間接免疫熒光法測定病毒滴度。

1.2.4 不同MOI對病毒滴度的影響 分別按0.02 MOI、0.04 MOI、0.1 MOI進行0 h接毒實驗，接毒細胞密度0.5×106/mL，接毒的同時加入2%D-G(V/V)，收獲時間均為72 h，收獲后用間接免疫熒光法測定病毒滴度。

1.2.5 帶毒傳代連續收獲產毒情況 由于感染PCV2的PK15細胞可帶毒傳代，所以該馴化細胞也進行帶毒傳代，接毒細胞密度0.5×106/mL，按照0.04 MOI接毒，同時加入2% D-G(V/V)，培養72 h后，按傳代比例收獲病毒并帶毒繼續傳代的方法，連續收獲三次，收獲后用間接免疫熒光法測定病毒滴度。

1.2.6 病毒滴度的測定

1.2.6.1 收獲液的處理 將搖瓶中收獲的PCV2病毒液反復凍融3次后，1000 r/min離心5 min后取上清液待檢測。

1.2.6.2 檢測 在96孔培養板中每孔加入100 μL用含8%新生牛血清的DMEM-F12生長液制成的濃度為2×105/mL的PK15細胞懸液，待細胞長至24 h左右，棄掉板內培養液，把待測的PCV2病毒懸液作10倍系列稀釋，稀釋液為加入含2% D-G的2%新生牛血清的DMEM-F12，每個稀釋度接種6個孔，每個孔100 μL；陰性對照6孔，加入制備好的細胞懸液100 μL；在37 ℃、5% CO2培養箱中培養96 h后，取出孔板，棄掉孔內培養基，在通風櫥內加入200 μL 80%丙酮，放在4 ℃固定1 h后取出孔板，吸去孔內丙酮，用PBS洗滌3 次/min，加入圓環單克隆抗體(工作濃度稀釋倍數)，每孔200 μL，37 ℃孵育1 h，取出用PBS洗滌3 次/min，加入羊抗鼠熒光抗體(工作濃度稀釋倍數)50 μL，37 ℃避光孵育1 h，取出用PBS洗滌后鏡檢觀察，待檢樣品出現綠色熒光為陽性，陰性對照無綠色熒光，按照Reed-Muench法計算病毒滴度。

2 結果與分析

2.1 PK15細胞無血清全懸浮馴化 該株貼壁PK15細胞，從復蘇到最終馴化成全懸浮PK15-S細胞，經過3種培養方法的過渡(表1)，共23次傳代，細胞狀態良好，活率較高，可凍存保種。為了驗證該馴化細胞的穩定性，本實驗又將馴化后凍存細胞再次復蘇，并按初始密度0.5×106/mL連續傳11代，細胞長勢良好，倍增時間穩定，結果見表2。

表1 訓化過程中的細胞情況

表2 PK15-S細胞復蘇后傳代生長情況

2.2 PCV2對PK15-S細胞敏感性試驗 細胞馴化完成后，需及時進行毒的敏感性試驗，取復蘇后傳代3次的PK15-S細胞進行接毒試驗，毒種滴度為105.5TCID50/mL，細胞初始密度為0.5×106/mL，0 h接毒，經過72 h的帶毒培養，細胞仍可增殖至4.24×106/mL，收獲時細胞活率為94.6%，取48 h、72 h收獲液用間接免疫熒光法測定病毒滴度分別為104.5TCID50/mL、106.0TCID50/mL，證實此PCV2對該馴化株PK15-S仍有較好的敏感性，結果見表3。

表3 PCV2對PK15-S細胞敏感性情況

2.3 不同接毒時間對病毒滴度的影響 為驗證接毒的最佳時間，取兩組復蘇后傳代三次的PK15-S細胞，初始密度都為0.5×106/mL，分別在0 h和24 h進行接毒，分別培養72 h和96 h，兩組試驗在48 h和72 h進行取樣檢測，0 h接毒組病毒滴度分別為104.5TCID50/mL、106.0TCID50/mL，24 h接毒組病毒滴度分別為104TCID50/mL、104.5TCID50/mL，試驗最終收獲時，兩組細胞都有較高的活率，分別為94.6%、97.0%。通過以上數據可以得出，該馴化株PK15-S細胞0 h接毒培養滴度優于24 h接毒培養滴度，結果見表4。

表4 接毒時間對病毒滴度的影響

2.4 不同MOI對病毒滴度的影響 三組試驗按不同MOI接毒后，培養72 h，分別在48 h和72 h取樣檢測，0.02 MOI組病毒滴度分別為104.4TCID50/mL、105.4TCID50/mL，0.04 MOI組病毒滴度分別為104.5TCID50/mL、106.0TCID50/mL，0.1 MOI組病毒滴度分別為105.4TCID50/mL、106.4TCID50/mL。由表5可見，細胞培養至72 h后，前兩組細胞密度都超過了4.0×106/mL，細胞活率都在95%左右，最后一組細胞密度和細胞活率都略低于前兩組，密度為3.45×106/mL，活率為90.5%。僅就滴度而言，MOI為0.1時病毒滴度最高，可達106.4TCID50/mL。

表5 MOI對病毒滴度的影響

2.5 帶毒傳代連續收獲產毒情況 當MOI為0.1時，72 h細胞數和細胞活率均沒有MOI為0.04的理想，故連續收獲按照0.04 MOI接毒，接毒時細胞密度為0.5×106/mL，培養72 h后，按傳代比例收獲病毒并帶毒繼續傳代的方法，在顯微鏡下觀察帶毒傳代細胞，細胞狀態良好，輪廓清晰可見，結果見圖1；連續收獲三次，收獲樣品用間接免疫熒光法測定病毒滴度分別為106.0TCID50/mL、106.25TCID50/mL、106.5TCID50/mL，三個代次收獲的病毒液滴度均達到預期，結果見表6，可采用連續收獲方式進行病毒的收獲。

圖1 帶毒傳代細胞狀態顯微觀察(TB染色，40×)

表6 帶毒傳代連續收獲產毒情況

3 討論與結論

目前大規模培養PCV2的方法主要有轉瓶和生物反應器微載體培養。轉瓶工藝存在勞動強度大，需要溫室配合，單位面積細胞可用率低等缺點，隨著工藝的提升，滾瓶工藝也將逐漸被淘汰；微載體工藝雖說提升了細胞密度，也增加了培養基的使用效率，批間差異小，培養條件可控，但仍存在成本控制、放大傳代消化等問題，且兩種工藝均需要血清的添加，血清的添加不但使成本增加又存在血清的批間差異大、外源病毒引入、下游純化去除等問題。因此，馴化一株可無血清全懸浮培養的PK15細胞用于培養PCV2可以將工藝進一步提升。

本文將一株貼壁PK15細胞經過3種培養方法的馴化，將其馴化為可全懸浮無血清培養的PK15細胞并命名為PK15-S，然后進行了PCV2接毒條件的摸索，對接毒時間、MOI、收獲時間以及收獲方式進行了試驗分析。試驗結果表明，該細胞培養PCV2，采用批次收獲時，接毒時細胞密度為0.5×106/mL，添加2% D-G，接毒量為0.1 MOI，收毒時間為接毒后72 h，病毒滴度為106.4TCID50/mL；但如果采用連續收獲，接毒和傳代時均使細胞密度為0.5×106/mL，添加2% D-G，接毒量為0.04 MOI，收毒時間為接毒后72 h，連續收獲3代，病毒滴度分別為106.0TCID50/mL、106.25TCID50/mL、106.5TCID50/mL，病毒滴度和收獲液體積較為理想。

通過本試驗可知，帶毒傳代的細胞在需要傳代的72 h，細胞密度分別為4.24×106/mL、2.93×106/mL、2.41×106/mL，細胞密度呈降低趨勢，除了第一代帶毒細胞外，第二代、第三代均并未達到預期傳代密度，雖說PK15感染PCV2后并不引起細胞的病變，但在本試驗中隨著帶毒傳代的次數增加，病毒對細胞的生長的確造成了一定的影響，說明仍需對帶毒傳代細胞的培養環境進行優化和改良，這也意味著第二代、第三代的病毒收獲液體積的減少，在實際生產中將會造成產量下降問題。但就整體工藝而言，該株馴化PK15細胞培養PCV2的接毒培養條件和收獲方式存在一定可操作性，可為大規模培養PCV2提供數據支撐。