赤黃止痢顆粒中赤芍的薄層色譜鑒別與含量測(cè)定方法的建立

尚靜雪，蘇岳樂(lè)，張鵬舉，蔡小利，張遠(yuǎn)達(dá)，戰(zhàn) 文，何鴻毅，付麗云，李海華，陳志強(qiáng)*

(1.內(nèi)蒙古華天制藥有限公司，內(nèi)蒙古赤峰 024070；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)獸藥監(jiān)察所，呼和浩特 010020；3. 赤峰市藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古赤峰 024000)

大腸桿菌和痢疾桿菌是導(dǎo)致痢疾最為常見(jiàn)的病原菌[1]，目前，臨床上采用的常規(guī)抗菌西藥療法收到的效果并不理想[2]。劉筱[3]的藥效學(xué)和安全性研究試驗(yàn)結(jié)果顯示赤黃止痢顆粒有效率高達(dá)100%，治愈率可達(dá)80%，臨床效果明顯，開(kāi)發(fā)該中獸藥復(fù)方制劑不僅可為養(yǎng)殖市場(chǎng)提供“無(wú)抗藥”，滿足消費(fèi)者對(duì)食品安全的要求，而且能夠推動(dòng)和發(fā)展“傳統(tǒng)中獸藥新制法”的科學(xué)療法和健康養(yǎng)殖的理念，具有廣闊的發(fā)展前景。

赤黃止痢顆粒是由赤芍和黃柏2味中藥提取濃縮后，添加一定輔料制備而成的中藥復(fù)方顆粒，主治畜禽痢疾。方中赤芍始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，其曰：“主邪氣腹痛，除血痹，破堅(jiān)積，寒熱疝瘕，止痛[4]”。黃柏始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》原名“果木”，列為上品，屬于清熱燥濕類藥物[5]?！堕愂闲悍秸摗分杏涊d：赤芍四錢、黃柏半兩，具清熱止痢的功能。實(shí)驗(yàn)室又通過(guò)大量中藥體外抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，赤芍、黃柏兩味藥聯(lián)用對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌菌的藥敏試驗(yàn)中，其FIC<0.5，具有聯(lián)合抑菌作用。本文主要研究赤黃止痢顆粒中赤芍的薄層鑒別和含量測(cè)定項(xiàng)的分析方法。為使產(chǎn)品安全、有效、質(zhì)量可控，制定合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)很重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 赤黃止痢顆粒(批號(hào)200701、200702、200703)為內(nèi)蒙古華天制藥有限公司制備的3批樣品。

1.1.2 主要試劑及儀器 芍藥苷對(duì)照品(來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736-201943)；甲醇為色譜純購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為超純水，乙醇、甲醇等其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

超聲波清洗器(SK1200H)購(gòu)自上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；電子天平(TD10002C)購(gòu)自天津天馬衡基儀器有限公司； 電子分析天平(BT-125D)購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；水浴鍋(HH-4)購(gòu)自江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；高效液相色譜儀(LC-2030C Plus)購(gòu)自島津公司；色譜柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；購(gòu)自島津公司、北京綠百草科技發(fā)展有限公司和安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 赤黃止痢顆粒的定性鑒別方法

1.2.1.1 赤芍的鑒別 取本品適量研磨成細(xì)粉，取細(xì)粉1 g，加乙醇10 mL，超聲20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)。

1.2.1.2 專屬性考察 取赤黃止痢顆粒樣品和分別缺少赤芍的陰性樣品，按上述相應(yīng)方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果考察該方法對(duì)藥材的薄層鑒別是否具有專屬性。

1.2.1.3 重復(fù)性考察 取3批樣品，按上述相應(yīng)方法檢測(cè)，考察該方法的重復(fù)性。

1.2.1.4 耐用性考察 取赤黃止痢顆粒樣品按上述相應(yīng)方法檢測(cè)，分別點(diǎn)于3個(gè)不同廠家的薄層板上，考察該方法的耐用性。

1.2.2 赤黃止痢顆粒含量測(cè)定方法

1.2.2.1 赤芍色譜條件 色譜柱：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent 4.6 mm×250 mm，5um)，以甲醇為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B；按(36∶64)進(jìn)行等度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算不應(yīng)低于2000。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量研磨成細(xì)粉，取細(xì)粉1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲冷卻20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.4 陰性樣品溶液制備 取缺赤芍的處方藥材制備成缺赤芍的赤黃止痢顆粒樣品，同“1.2.2.3”方法制成陰性樣品溶液。

1.2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液各10 μL，連續(xù)6次注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.2.6 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.2.7 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，制成不同濃度的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，分別在制備后0、2、8、12、18和24 h測(cè)定芍藥苷的峰面積。

1.2.2.9 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取同一批顆粒劑樣品6份研磨成細(xì)粉，每份取細(xì)粉0.5 g，照供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備，分別進(jìn)樣10 μL，按上述“1.2.4.1”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.10 回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批赤黃止痢顆粒樣品9份(含量為0.50%)，每份分別按赤黃止痢顆粒中含有芍藥苷量的80%、100%和120%加入對(duì)照品溶液，各3份，再按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備，精密吸取5 μL，按上述色譜條件測(cè)定芍藥苷的峰面積，計(jì)算平均回收率。

1.2.2.11 耐用性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液5 μl，測(cè)定芍藥苷的峰面積并計(jì)算芍藥苷含量，分別考察不同廠家(島津、綠百草和安捷倫)色譜柱、不同流速(0.8、1.0 mL/min)和不同柱溫(20、25和30 ℃)對(duì)芍藥苷含量測(cè)定的影響。

1.2.2.12 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，各批次三份平行樣品，按對(duì)照品、供試品溶液制備方法制備好對(duì)照品和供試品溶液，精密吸取供試品溶液及對(duì)照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，按“1.2.4.1”中色譜條件進(jìn)樣、測(cè)定、記錄峰面積。計(jì)算樣品中芍藥苷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤黃止痢顆粒中赤芍的定性鑒別結(jié)果

2.1.1 專屬性和重現(xiàn)性 赤芍的薄層鑒別：由圖1可知，赤黃止痢顆粒樣品色譜在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)。缺赤芍的陰性樣品色譜在與相同的位置上無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，方法具有專一性。

1,5：對(duì)照品；2：陰性樣品；3～4：樣品

2.2.2 耐用性考察結(jié)果 赤芍的耐用性結(jié)果見(jiàn)圖2，在3個(gè)不同廠家的硅膠G薄層板上3批赤黃止痢顆粒樣品色譜與芍藥苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的的位置上，均顯示相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)。

1,5：芍藥苷對(duì)照品；2～4：赤黃止痢顆粒;3:批樣品

2.3 赤黃止痢顆粒的含量測(cè)定結(jié)果

2.3.1 精密度試驗(yàn) 芍藥苷峰面積6次進(jìn)樣結(jié)果分別為：2637993、2643986、2635589、2646308、2654697和2667774，RSD=0.45%(n=6)，表明精密度良好。

2.3.2 專屬性試驗(yàn) 專屬性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，芍藥苷的保留時(shí)間為8.638 min，陰性樣品對(duì)測(cè)定干擾，結(jié)果表明專屬性良好。

A：對(duì)照品溶液；B：陰性對(duì)照品溶液;C:供試品溶液

2.3.3 線性關(guān)系試驗(yàn) 通過(guò)線性關(guān)系分析得到回歸方程：15115057.2000x + 152337.2667， R2=0.9996。結(jié)果表明，芍藥苷在0.25～2.0 mg范圍內(nèi)與其色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸曲線見(jiàn)圖4。

圖4 芍藥苷回歸曲線

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 放置0、2、8、12、18和24 h的赤黃止痢顆粒中芍藥苷峰面積分別為2933920、3031287、2865617、2934849、2983689和2953168，RSD為1.93%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 由表2可知，RSD為0.81%，表明樣品重現(xiàn)性良好。

表1 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.6 回收率試驗(yàn) 通過(guò)測(cè)定芍藥苷的峰面積，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表3，芍藥苷平均回收率為99.74%，RSD為1.95%(n=9)，表明該方法準(zhǔn)確可信。

2.3.7 耐用性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，色譜柱為島津和綠百草的分離度小于1.5且拖尾因子大于1.05，色譜柱為安捷倫的分離度大于1.5且拖尾因子在0.95～1.05之間，表明赤黃止痢顆粒中赤芍含量測(cè)定適用于安捷倫色譜柱；不同流速進(jìn)樣測(cè)定試驗(yàn)芍藥苷的峰面積，其含量平均值為0.54%，RSD為1.71%，表明流速變化±0.2 mL/min耐用性良好；不同柱溫進(jìn)樣測(cè)定芍藥苷的峰面積，計(jì)算得芍藥苷的含量平均值為0.52%，RSD為1.69%，表明柱溫變化±5 ℃的耐用性良好。

2.3.8 樣品含量測(cè)定 3批赤黃止痢顆粒樣品各批次三份平行樣品的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，計(jì)算含量平均值為0.51%，RSD為0.041%。參照《中國(guó)獸藥典》含量限度的一般要求，并結(jié)合赤黃止痢顆粒各批次含量測(cè)定結(jié)果，將赤黃止痢顆粒含量限度擬定為：本品含赤芍以芍藥苷(C23H28O11)計(jì)不得少于0.4%。

3 討論與結(jié)論

3.1 有關(guān)薄層色譜鑒別方法 赤黃止痢顆粒應(yīng)工藝制備需求在處方中需添加適量輔料，故在薄層色譜鑒別預(yù)試驗(yàn)中供試品溶液的制備考慮使用中性氧化鋁柱[14]和未使用中性氧化鋁柱對(duì)其影響，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)中性氧化鋁柱前處理的供試品溶液較未使用中性氧化鋁柱的供試品溶液薄層鑒別斑點(diǎn)顏色較淺，說(shuō)明使用中性氧化鋁柱前處理對(duì)芍藥苷的薄層鑒別有少許影響。因此，芍藥苷供試品溶液不需要經(jīng)中性氧化鋁柱前處理。參照藥典中赤芍藥材的鑒別方法，對(duì)其進(jìn)行專屬性、重現(xiàn)性和耐用性等方面考察，結(jié)果表明該TLC方法穩(wěn)定、可行，適用于赤黃止痢顆粒中赤芍藥材的鑒別。同時(shí)，李柯[15]等對(duì)芪芍化纖柔肝湯中赤芍參照藥典方法進(jìn)行薄層鑒別，結(jié)果顯示鑒別效果較好。

3.2 有關(guān)含量測(cè)定項(xiàng)檢測(cè)方法 赤芍為毛茛科植物赤芍或川赤芍的干燥根，具有清熱涼血，散瘀止痛的功效[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其主要化學(xué)成分為芍藥苷，主要占比約3.1%～7.0%[16]，本研究為更好地控制制劑質(zhì)量，采用HPLC法建立赤黃止痢顆粒中芍藥苷的含量測(cè)定。

波長(zhǎng)的選擇：取供試品溶液在紫外分光光度計(jì)中200～400 nm區(qū)間掃面，結(jié)果在230 nm處芍藥苷的吸光度最大，故選用230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

色譜柱的選擇：試驗(yàn)考察了不同色譜柱對(duì)芍藥苷色譜峰分離的影響，色譜柱廠家分別為島津、綠百草和安捷倫。結(jié)果表明色譜柱為Agilent (4.6 mm×250 mm，5um)時(shí)供試品色譜峰的分離度大于1.5且拖尾因子在0.95～1.05之間，因此色譜柱選擇Agilent (4.6 mm×250 mm，5um)。

流動(dòng)相的選擇：文獻(xiàn)[17-20]報(bào)道，高效液相色譜法測(cè)定中藥芍藥苷的流動(dòng)相系統(tǒng)有乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-水、甲醇- 0.1%磷酸溶液、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液等，考察其分離度和峰形等，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇- 0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)峰面積的分離度與峰形較好。

3.3 結(jié)論 本試驗(yàn)建立的赤黃止痢顆粒中赤芍的薄層色譜鑒定方法，分離效果好，專屬性強(qiáng)、重復(fù)性高；建立的赤黃止痢顆粒中芍藥苷含量測(cè)定的HPLC分析方法，結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、精密度高，選擇的流動(dòng)相降低對(duì)儀器系統(tǒng)和色譜柱的損傷，可用作赤黃止痢顆粒中芍藥苷的含量測(cè)定。因赤黃止痢顆粒為內(nèi)蒙古華天制藥有限公司自主研發(fā)的新中獸藥復(fù)方制劑，主要用于治療畜禽痢疾。檢索有關(guān)資料，未發(fā)現(xiàn)本制劑相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)，故本試驗(yàn)建立的赤黃止痢顆粒中赤芍的薄層色譜鑒別方法和含量測(cè)定分析方法，為赤黃止痢顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了方法學(xué)依據(jù)。