基于尿素酶的幽門螺桿菌唾液檢測分析

李若彬，王柯為，李夢娜，楊賀迪，冷鋒

哈爾濱醫科大學大慶校區，黑龍江 大慶 163000

0 引言

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種螺旋形、微厭氧、對生長條件要求十分苛刻的細菌。1983年首次從慢性活動性胃炎患者的胃黏膜活檢組織中分離成功，是目前所知能夠在人胃中生存的唯一微生物種類，能夠導致Hp病包括由Hp感染引起的胃炎、消化道潰瘍、淋巴增生性胃淋巴瘤等，存在于大多數慢性胃炎患者的胃黏膜上皮表面或腺體的黏液層中[1-2]。在發達國家，大約占比30%～60%，在發展中國家，大約占比60%。Hp能產生大量的脲酶，其活性是其他變形桿菌的20～70倍，是所有已知產生脲酶的細菌中最活躍的。Hp產生脲酶，該酶催化游離氨的產生[3]。氨氣在Hp周圍形成“氨氣云”，中和胃酸，保護Hp免受胃黏膜酸性環境的影響。醫學從業人員認為體內的Hp通?？梢韵瑧M行全國普查。至少那些曾經做過胃部手術、胃部疾病或者胃癌的患者應該接受Hp檢測，感染者應接受殺菌治療，希望能夠控制胃癌。

1 檢測材料

Hp唾液檢測試劑：尿素50g，酵母浸膏0.1g，酚紅0.01g，乙醇，PH計。

呼氣試驗：13C呼氣試驗分析儀（WLD600），13C膠囊。

2 實驗檢測

2.1 Hp唾液檢測方法

2.1.1 采樣預處理

患者一周之內不可服用抗生素，鉍劑，質子泵抑制劑等藥物，留取唾液樣本前一晚十二點之后禁食禁水（見圖1）。清晨刷牙前留取唾液樣本至采集管1，通過調節唾液PH酸堿度至6.8降低唾液鏈球菌酶活性，減少其對實驗結果的影響。

圖1 實驗檢測步驟

2.1.2 口腔Hp半定量檢測

將采樣預處理后的樣本用膠頭滴管吸入3～5滴，放入配置好的反應盒內，5min后觀察其顏色改變，通過比色法進行酶動力學實驗，以此實現對Hp的半定量[4]。5min后反應試劑盒內溶液為黃色則為陰性，變為紅色則顯示陽性，且隨著HP含量的增加，溶液的顏色也會隨之加深，由淺紅色變為深紅色或玫紅色[5-6]。

2.2 13C呼氣試驗

呼氣試驗是檢測Hp感染的首選方法，主要是13C和14C尿素呼氣試驗，具體如下：

（1）呼氣試驗檢測Hp主要是通過13C和14C的尿素呼氣試驗，由于尿素能夠在尿素酶的作用下生成氨和CO2，在患者進行呼氣試驗的時候可以先服用一顆有標記的13C或14C尿素，當患者體內有Hp時，它就可以被分解為氨和CO2，在使用同位素標記的CO2將會通過呼吸道排放到體外，因此可以用患者呼氣來檢測Hp感染的情況，同位素標記的CO2越多則Hp感染的情況越嚴重[7-8]。

（2）呼氣試驗無創無痛，減輕了患者的疼痛感，并且敏感性高，檢測的準確性率高，不會造成交叉感染，所以Hp的檢測首選呼氣試驗的方法13C呼吸試驗檢測的方法，通過檢測被13C標記的CO2是否超過100dpm來確定是否有Hp感染，本文主要運用的是13C[9-10]。

3 實驗分析

3.1 尿素濃度與反應時間確定

尿素酶催化尿素水解，生成兩分子的氨和一分子的CO2，同時也引起溶液PH的變化（見圖2），因此，分別將濃度為0.1、0.7、7、30、50、70、140g/L的10mL尿素溶液與1mL，0.5U/mL的尿素酶溶液混合，30min后檢測其PH酸堿度，結果顯示，尿素濃度在0.7、7、30、50、70g/L時，PH變化最為明顯，且5組數據之間無顯著差異。據此，本實驗試劑尿素溶液濃度設置為50g/L。

圖2 不同濃度尿素溶液檢測結果

將10mL的尿素溶液與0.5U/mL的尿素酶溶液充分混合，靜置5min，30min，60min，90min，分別檢測其PH變化，經過多次實驗發現，在反應時間為5min時其PH酸堿度與反應時間30min的PH酸堿度無顯著差異。據此本檢測方式設定反應時間為5min。

3.2 唾液鏈球菌的分析

口腔中的唾液鏈球菌是最為主要的產生尿素酶分解尿素的細菌，因此會對實驗結果產生一定影響。根據唾液鏈球菌的酶活性數據與PH數據，結合matlab軟件進行數據擬合，軟件擬合得出的R-square=0.9613，可以看出擬合的精確度較高，同時也符合實際情況，詳見表1。

表1 唾液鏈球菌酶活性與PH關系變化圖表

3.3 評價指標

本文對200組檢測結果進行綜合分析，對檢測結果的靈敏性、特異性、陽性預測值、陰性預測值、準確率、一致性進行統計分析，具體方法如下：

計算靈敏度數學方法：靈敏度的計算需要與陽性標本數與總陽性標本數有關，計算公式如下：

計算特異性數學方法：特異性的計算主要與陰性標本數與總的陰性標本數有關，計算公式如下：

計算特異性數學方法：陽性預測值主要與真陽性標本數和診斷實驗結果呈陽性標本數有關,計算公式如下：

計算陰性預測值數學方法：陰性預測值主要與真陰性標本數和診斷實驗結果呈陰性標本數有關,計算公式如下：

計算準確性數學方法：準確性主要與真陽性標本數、真陰性標本數以及總標本數有關,計算公式如下：

計算一致性數學方法：計算一致性主要與共陽性標本數和陽性總數有關，計算公式如下：

4 實驗結果

在200例受試者中，Hp唾液檢測試劑盒檢測出受試者陽性的數目為122例，Hp唾液檢測試劑盒檢測出受試者陰性的數目為78例；Hp唾液檢測試劑盒檢測出受試者13C陽性的數目為117例，Hp唾液檢測試劑盒檢測出受試者陰性的數83例，122例Hp唾液檢測試劑盒陽性標本對應13C陽性117例，Hp唾液檢測試劑盒陽性標本對應假陽性7例；78例Hp唾液檢測試劑盒陰性標本對應13C陰性83例，Hp唾液檢測試劑盒陰性標本對應假陰性2例；本實驗所采用的試劑盒靈敏性通過前面數學方法計算達到了98.29%，特異性通過前面數學方法計算達到了90.36%，陽性預測值通過前面數學方法計算達到了94.26%，陰性預測值通過前面數學方法計算達到了96.15%，準確性通過前面數學方法計算達到了95%，差異性通過前面數學方法計算達到了5%，低于實驗允許變異系數（10%），所以本實驗具有很高可行性與可信度[11-14]。

5 討論

Hp經口到達胃黏膜后定居感染，會引發慢性、淺表性胃炎、潰瘍、淋巴增生性胃淋巴瘤、慢性萎縮性胃炎、腸化生、胃癌等，大量研究數據表明口腔中存在Hp，且具有較高的檢出率[15-16]。

Hp產生尿素酶，可分解尿素生成CO2和氨氣。13C呼氣試驗通過標記、檢測Hp尿素酶分解生成的CO2，實現對Hp的檢測；Hp唾液檢測試劑盒，通過檢測被氨氣堿化的溶液，確定是否有Hp感染[17-18]。Hp唾液檢測試劑盒與13C呼氣試驗檢測結果存在一定差異，但是差異性為5%，低于實驗允許變異系數10%，無統計學意義。Hp唾液檢測試劑盒實驗標本為唾液[19]，對人體無危害，且檢測時間短，操作簡單，可重復檢測，適用于家庭、學校的初查。

6 防治建議

想要徹底的把Hp消滅并不是一件困難的事，大約85%的細菌感染者經過7～14d的正確治療過后，位于身體內部的Hp幾乎能夠被徹底消除[20-21]。我們提出如下建議，應該有一定周期性的開展全民普查，對接受過胃部手術、有過胃病、或親屬中有過胃癌的人進行Hp的定時檢查，同時在感染者進行合理的殺菌治療，這樣有利于防控胃癌的發生，減少全國胃癌發病率[22-23]。