腦膜瘤組織中組織蛋白酶異常表達及其診斷價值研究

李立，譚超華，周燦宦，蔡曉燕

臺山市人民醫院 病理科，廣東 臺山 529200

0 引言

腦膜瘤是顱內常見性腫瘤，于所有顱內原發腫瘤中占24%左右。腦腫瘤所體現的生物學特點是附近腦內侵襲早期腫瘤細胞，整個環節與組織蛋白酶具有相關性，蛋白酶也被作為診斷標記惡性腫瘤的記號[1]。腦膜瘤多數均是良性生長，惡性腦膜瘤和非典型于全部腦膜瘤中占據10%，其侵襲性較多，即使采用手術切除，10年內的復發率也依然高達15%，不典型的惡性腫瘤切除后5年內即為復發，且高達78%。鑒別良惡性的方式眾多，當下尚無預測因子、生化標記來區分良惡性。組織蛋白酶B（cathepsin B，Cat B）經內源性抑制因子調整，在半胱氨酸蛋白酶超家族中有一席之地，參與腫瘤的浸潤與轉移，能夠對細胞外基質發揮良好的降解作用[2]。文章主要分析腦膜瘤Cat B的表達水平，探索其與酶抑制因子之間的關系，研究其在良惡性區分中的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018年1月-2020年1月本院取100例腦膜瘤患者腫瘤組織標本，男女均50例，年齡20～73歲，平均（54.5±3.6）歲；矢狀竇旁26例，大腦凸面34例，顱底腦膜瘤40例。全部標本均安排經驗豐富的醫師獨立對其重新歸類和分析。所有參與的患者均知情自愿參與研究。此次研究已獲得本院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 分析組織學

選擇具有代表性的腫瘤組織制為4μm厚石蠟切片，染色用[蘇木素-伊紅（H.E）]，免疫標記為Cat B、胱抑素（cystatins，Cys）。結合腫瘤分級標準對腫瘤分類，良、惡性與非典型性。

1.2.2 分析免疫組化

用廣州提供的試劑盒展開操作。依據試劑盒步驟執行，固定4%多聚甲醛，包埋石蠟，連續切片，厚度4μm，常規脫蠟用水，取雙氧水甲醇液（3%），在室溫下20min消除內源性過氧化物酶，在枸櫞酸緩沖液0.01mol/L緩沖液中進行10min高壓修復，正常山羊血清10%密閉10min，在37℃下，依次加入1:100兔抗人CatB抗體孵育2h，生物素化標記二抗工作液30min，辣根酶標注的SP工作液30min。DAB顯色，蘇木素復染。每次研究同時用PBS替換一抗為陰性對抗，Cat B陽性是棕色。

1.2.3 免疫組化評分

腫瘤細胞免疫標注的強度與頻率能夠綜合評估抑制劑A（stefin A）、胱抑素C（cystatin C），評分遵循組織化學評分標準，分值0～3分。人體細胞中Cat B反應頻率為陽性者記分為：評分以染色陽性腫瘤細胞占比為主，0分不存在；1分30%以下；2分30%～60%；3分60%以上；染色強度依據陰性、弱、中、強級別計為0、1、2、3[3]。取腫瘤細胞中CatB染色數據劃分為兩組，弱陽性小組：0～3分；強陽性組：4～6分。因染色強度過低，沒有評估Stefin A、Cystatin C染色。

1.3 統計學分析

按均值、頻度、卡方檢驗處理數據，P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結果

2.1 CatB于腦膜瘤中免疫組化胞內定位

CatB陽性表現：細胞質呈棕色，腦膜瘤細胞較深的是中棕色，以顆粒狀呈現，于胞質中分布，胞核、胞膜均為陰性。見圖1。

圖1 腦膜瘤組織中Cat B 表達免疫組織化學

2.2 不同位置腦膜瘤Cat B表達

全部腦膜瘤中，矢狀竇旁26例，大腦凸面34例，顱底腦膜瘤40例。其中，非典型性腦膜瘤、惡性腦膜瘤均處于矢狀竇旁、大腦凸面，顱底腦膜瘤中未出現非典型性、惡性腦膜瘤。Cat B于其中免疫組化高積分百分率分布為59%、69%、29%。經統計學分析，矢狀竇旁腦膜瘤與大腦凸面腦膜瘤差異不顯著（P＞0.05）。但矢狀竇旁腦膜瘤與大腦凸面腦膜瘤和顱底腦膜瘤比較，差異較大（P＜0.05）。

3 討論

腦膜瘤是顱內經常出現的腫瘤，一般呈良性。治療時因對化療和放療敏感度低下，最有效的治療方式當屬手術切除。但利用手術治療，很容易復發。當前尚未發現一類臨床與組織血標記物有效對疾病預后與分級進行評估，部分腦膜瘤于機體形態中樞中為良性，但臨床侵襲性較強。術后復發的原因是腦膜瘤侵襲性行為，患者長時間備受影響，無形中會使患者致殘和死亡。實踐發現，部分腫瘤可劃分在惡性瘤體中，需為患者支撐療法與短時間內隨訪。但部分腫瘤多數未得到認識，由于既往常以此評判腫瘤級別，外科手術中比較匱乏，處于正常腦組織界面中，這一界面是考察腫瘤是否存在侵襲的主要因素。不完全對瘤體的切除很容易導致腫瘤重復出現[4]。有時，以往的良性腫瘤復發時時而會有惡性特點，這一情況說明，腫瘤由良性向侵襲性發展的環節比較漫長，有必要探索全新的指標來區分腫瘤的發展。

腦膜瘤具有一定的侵襲性，腫瘤在侵襲時必須滿足三個條件，分別是黏附性、蛋白水解酶、細胞間黏附能力，這主要與黏附分子的不足相關。很多惡性腦膜瘤經對特異性整合素的表達以同分異構體表現，但不會表達E-鈣粘連素，細胞黏附性可迅速降低，侵襲性會增強。人體的基因產物在丟失后，蛋白會使得細胞丟失黏附能力。所以，涉及細胞接觸與細胞黏附不同蛋白-細胞骨架肌動蛋白、膜蛋白。雖然蛋白看起來有橋梁作用，但細胞黏附性不足會促進腫瘤的進一步浸潤和增殖。另外參與的腫瘤侵襲因子，細胞外基質蛋白水解酶包含的酶較多。抑制因子的調節主要和諸多腫瘤惡化相關，但活性良性與不典型的腦膜瘤高于惡性，這說明腫瘤的侵襲性行為與惡性進展相關。有學者認為，很多存在骨質增生的腦膜瘤病理在檢查時可發現腫瘤骨侵犯。還有學者表示，局部骨質增生主要是激活腫瘤酶的結果，會使細胞的活化增殖加快，伴骨質增生的腦膜瘤表達會上升。同理可得，腫瘤細胞分泌的體液因子可對骨細胞活化造成刺激，主要與腦膜瘤的骨質增生相關。

當前，還沒有組織血標志物，科學對病理分級與預后進行評估，部分腦膜瘤于組織形態可劃分到良性中，但臨床上具有較高侵襲性。腦膜瘤侵襲行為是術后復發的主要因素，不僅會對患者的預后造成影響，還容易致殘和致死。既往對腫瘤級別的評判中缺乏腦腫瘤與正常腦組織間界面，此界面對腫瘤是否具備侵襲性極為重要，和完全切除相比，腦膜瘤不完全切除更容易復發。以往的良性腫瘤復發時可發現惡性特點，這說明腫瘤會從良性發展到侵襲性再到惡性，整個過程較慢，需尋找全新的預示腦膜瘤進程的生物學指標。

腦腫瘤主要的表現特點是部分浸潤和初期腫瘤細胞浸潤大腦，這和金屬蛋白酶水平相關，因為蛋白酶經常作為診斷惡性腦膜瘤的標記。部分研究展現，組織蛋白酶與腫瘤進展密切，其主要是內源性抑制因子家族有三個，細胞外發揮作用的是Cystatin、Stefin[5]。經觀察，腦腫瘤中活性的降低是導致腫瘤向惡性發展的始作俑者。

腫瘤術后復發與腫瘤切除多少與腫瘤惡性程度有關，深入研究后發現：切除的腫瘤是諸多瘤體中惡化明顯的腫瘤，附近硬膜依然有很多難以用肉眼識別的腫瘤小結節，可能是手術切除不徹底的因素。經檢查染色體，原發性瘤體與術后瘤體在染色體表現上一致，腫瘤復發就是手術對病灶切除不徹底所造成[6]。現代分子生物研究的開展，使人們漸漸注意到腫瘤浸潤性與腫瘤細胞增殖活性和腫瘤浸潤性相關，是造成疾病復發的主要原因。研究中，組織蛋白酶D（cathepsin D）和腫瘤浸潤性相關[7]。作為一類酶類物質，其不僅能夠將基底膜溶解，而且能夠激活機體蛋白B，有效降解胞外基質，使腫瘤能夠迅速轉移和浸潤。雖然行手術切除，但瘤體附近顯微鏡認為正常的硬膜組織蛋白水平在細胞外基質已發生降解，硬膜受到浸潤[8]。進一步研究發現，顯微鏡下認為正常的病灶與瘤體病理級別有關，隨腫瘤惡化程度的加深，cathepsin D的表達要比未復發的水平高。

蛋白酶與抑制劑不同狀況表達會顯示腫瘤細胞變化與轉移，這類蛋白酶一般在溶酶體半胱氨酸蛋白酶中，需關注的是組織蛋白酶B與抑制劑。類型不同的患者血清中蛋白酶的變化展現其在腫瘤預后評價中存在潛在價值[9-10]。機體蛋白酶B為溶解人體半胱氨酸內切蛋白水解物質，作用較廣，在人體中參與生理、病理的全部環節，能夠促使腫瘤細胞轉移與浸潤，是診斷疾病的核心要點。組織蛋白酶在人體的多個細胞中廣泛分布，有助于蛋白質的多路徑降解，胞外蛋白質步入細胞則會對人體內蛋白酶水解，并在細胞消化，維持蛋白質降解與合成的平衡。其不僅能夠將蛋白前體激活，還與生理活化與免疫反應抗原加工有關。

本研究得出：CatB于惡性腦膜瘤中具有較高表達水平，且CatB于疾病中的表達也較高。這表示CatB和腦膜瘤的病變程度有關。臨床上，兩者均可用于區分疾病的良惡性。CatB在良性與非典型性上也具備優良的區分價值。

綜上所述，CatB水平明顯要比良性者高，有希望在后期對腦膜瘤的良惡性診斷提供重要線索。