長鏈非編碼RNA ST7-AS1靶控miR-580-3p對卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響研究

徐玉紅 張慧雅 王運根 陳君霞 周艷敏

卵巢癌是人類第七大常見癌癥，死亡率居婦科惡性腫瘤首位。據數據統計，2018年全球185個國家中，卵巢癌新發病例超過290 000例，死亡病例超過180 000例[1]。盡管手術和化療可以延長卵巢癌患者的生存期，但5年生存率仍然很低,不足30%[2]。作為卵巢癌預后不良的重要因素，腫瘤轉移和侵襲的具體機制尚未完全明確[3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是潛在的可用于癌癥篩查和診斷的新型腫瘤標志物[4]。lncRNA中ST7-AS1是近幾年新發現的重要癌癥因子，在胃癌、宮頸癌中表達異常[5-6]。目前，關于ST7-AS1在卵巢癌中的表達情況及具體作用機制研究相關報道不多。且經starBase3.0軟件分析預測miR-580-3p為ST7-AS作用靶點。基于此，本研究探討ST7-AS1在上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）組織中的表達情況，并分析其對卵巢癌細胞惡性生物學行為的影響及其與miR-580-3p的調控關系，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本和細胞株 收集2019年6月至2021年6月紹興市人民醫院30例卵巢癌患者手術切除并經病理學檢查確診的EOC組織標本，同時取配對的癌旁正常組織（距病灶邊緣＜3 cm）。EOC患者年齡41～84歲，中位年齡58.5歲；病理分期Ⅰ期11例，Ⅲ期15例，Ⅳ期4例。所有患者術前均未進行新輔助化療或中醫藥治療，組織標本采集后立即置于液氮中凍存。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。人卵巢癌A2780細胞株購自上海icell生物技術公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 胰酶，100 U/ml青、鏈霉素雙抗，FBS購自美國Gibco公司。1640培養基購自上海icell生物技術公司。TRIzol試劑、Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國invitrogen公司。逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。CCK-8試劑盒購自美國MedChemExpress公司。Transwell小室、Matrigel基質膠購自美國Corning公司。引物序列、小干擾 RNA（siRNA）、miR-580-3p 模擬物（miR-580-3p mimic）及陰性對照（NC mimic），ST7-AS1 野生型和突變型雙熒光素酶報告載體均由上海吉瑪制藥公司設計合成。雙熒光素酶報告系統檢測試劑盒購自美國Promega公司。熒光實時定量PCR儀購自德國Roche公司，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 EOC組織與癌旁正常組織ST7-AS1、miR-580-3p表達水平檢測 采用熒光實時定量PCR法。利用TRIzol試劑提取組織標本中的RNA，采用逆轉錄試劑盒將1 μg的總RNA反轉錄為cDNA，按熒光定量PCR試劑盒說明書進行qPCR。ST7-AS1的引物序列上游 5'-ACCCTACTCTGCCTCCCTTAT-3'，下游 5'-TAGCATCTGCCACCCAAATC-3'；miR-580-3p 的引物序列 5'-GCTGCGTTGAGAATGATGAATC-3'，下游 5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'，GADPH 的引物序列上游 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'，下 游5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'。以 GADPH 為內參基因，采用 2-ΔΔCt法計算 ST7-AS1 和 miR-580-3p 的相對表達水平。

1.2.2 細胞培養及轉染 采用siRNA轉染技術，設計合成si-ST7-AS1轉染入細胞，敲除卵巢癌A2780細胞中ST7-AS1，設計合成陰性對照si-NC轉染入細胞。具體如下：卵巢癌A2780細胞株在含10%FBS，1%雙抗和1%谷氨酰胺的1640培養基中培養，置于37℃、5% CO2的培養箱中，每1～2 d換液。將生長狀態良好的處于對數生長期的細胞接種于6孔培養板中，當細胞融合度達60%～70%時，根據Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書進行轉染，分別轉染si-ST7-AS1（si-ST7-AS1組）和陰性對照 si-NC（si-NC組）。轉染后48 h，采用熒光實時定量PCR法檢測兩組細胞ST7-AS1表達水平驗證轉染效果。

1.2.3 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將si-ST7-AS1組和si-NC組細胞重懸調整密度為1×104/ml，取100 μl/孔鋪于96孔培養板，于接種培養第6、24、48、72 h每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養板置于培養箱中繼續孵育1 h，在酶標儀上450 nm處測定各孔吸光度（OD）。

1.2.4 細胞遷移能力檢測 采用Transwell遷移實驗。細胞轉染48 h后消化離心，用無血清1640培養液將細胞重懸調整密度為 1×105/ml，Transwell上室加入200 μl/孔的細胞懸液，培養板下室每孔加入 500 μl/孔的完全培養液，培養板置于培養箱中繼續培養48 h后取出小室，甲醇固定和0.1%結晶紫溶液染色各30 min，PBS清洗。棉簽擦拭上室中未穿過基底膜的卵巢癌細胞。100倍顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野拍照，對穿過基底膜的卵巢癌細胞進行計數，取平均值。

1.2.5 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。將Matrigel基質膠與1640空培養液按1:8比例稀釋后輕輕混勻，以100 μl/孔加入到Transwell小室的上室中，將培養板置于培養箱中6 h以充分凝固。后續同Transwell遷移實驗。

1.2.6 雙熒光素酶報告試驗 將構建好的ST7-AS1野生型（WT-ST7-AS1）和突變型（MUT-ST7-AS1）雙熒光素酶報告載體分別與miR-580-3p mimic或NC mimic共轉染卵巢癌A2780細胞，轉染48 h后，收集并裂解細胞，離心收集上清液，根據試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EOC組織與癌旁正常組織ST7-AS1表達水平比較 ST7-AS1在EOC組織中的表達水平（2.23±1.34）高于癌旁正常組織（1.23±0.70），差異有統計學意義（P＜0.01），見圖 1。

圖1 EOC組織與癌旁正常組織ST7-AS1表達水平比較

2.2 si-ST7-AS1組與si-NC組卵巢癌細胞ST7-AS1表達水平及增殖、遷移、侵襲能力比較 與si-NC組相比，si-ST7-AS1組卵巢癌細胞ST7-AS1表達水平明顯降低[（0.41±0.07）比（1.01±0.15）]，差異有統計學意義（P＜0.01），即轉染成功，見圖 2a。下調 ST7-AS1表達后，si-ST7-AS1組細胞 24、48、72 h細胞增殖能力分別為 0.58±0.01、0.80±0.04、0.91±0.05，低于 si-NC 組0.63±0.04、0.88±0.03、1.18±0.09，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2b。Transwell遷移實驗表明，與si-NC 組（715.20±28.43）相比，si-ST7-AS1組（359.20±22.88）穿過基底膜的細胞數減少（P＜0.01），見圖 2c。Transwell侵襲實驗表明，與 si-NC 組（736.40±32.59）相比，si-ST7-AS1組（320.40±29.35）穿過基底膜的細胞數減少，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2d。

圖2 si-ST7-AS1組與si-NC組卵巢癌細胞ST7-AS1表達水平及增殖、遷移、侵襲能力比較[a：ST7-AS1表達水平比較；b：增殖能力比較；c：遷移能力比較（×100）；d：侵襲能力比較（×100）]

2.3 ST7-AS1靶向調控miR-580-3p驗證結果 通過starBase3.0軟件分析預測顯示，ST7-AS1序列中含有與miR-580-3p互補的結合位點，見圖3a。與NC mimic組細胞（0.98±0.07）相比，miR-580-3p mimic組細胞（0.61±0.09）野生型WT-ST7-AS1的熒光素酶相對活性顯著下降（P＜0.01），而兩組的突變型MUT-ST7-AS1的熒光素酶相對活性沒有明顯變化[（0.96±0.07）比（0.95±0.08），P ＞0.05]，見圖 3b。與癌旁正常組織（1.17±0.71）相比，miR-580-3p在卵巢癌組織（0.71±0.39）中的表達水平下降（P＜0.01），見圖 3c。si-ST7-AS1組細胞miR-580-3p的表達水平為(4.69±1.39)，較si-NC 組（1.08±0.47）升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 3d。

圖3 ST7-AS1靶向調控 miR-580-3p驗證結果（a：軟件預測結果；b：WT-ST7-AS1、MUT-ST7-AS1熒光素酶活性比較；c、d：分別為組織細胞miR-580-3p表達水平比較）

3 討論

目前研究認為，lncRNA可通過影響細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、細胞周期等途徑參與腫瘤疾病發生、發展[7]。多種lncRNA在卵巢癌中發揮了致癌或抑癌的作用。Xu等[8]研究發現，卵巢癌組織中lncRNA EIBC表達上調，lncRNA EIBC的表達水平與腫瘤體積、淋巴結轉移、預后等密切相關，抑制lncRNA EIBC表達后卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力下降，且順鉑耐藥性被抑制。lncRNA GAS5表達水平在卵巢癌組織中降低，卵巢癌細胞中過表達lncRNA GAS5可明顯抑制癌細胞增殖及克隆形成，促進細胞凋亡，深入研究lncRNA GAS5的致病機制發現其在卵巢癌中可能通過細胞炎性壞死發揮作用[9]。目前，多項研究表明，lncRNA ST7-AS1在癌癥中表達失調，可作為潛在的新型的腫瘤標志物。Zhang等[10]研究表明，ST7-AS1與乳腺癌免疫浸潤相關，是乳腺癌潛在的新型預測指標。Qin等[11]研究發現111種與喉鱗狀細胞癌相關的lncRNA，ST7-AS1表現出最高的表達異常。ST7-AS1在喉癌組織及細胞中表達升高,它可以與組蛋白精氨酸甲基轉移酶 1（coactivatorassociated arginine methyltransferase 1，CARM1）相互作用，通過ST7-AS1/CARM1/Sox-2信號軸在喉癌中發揮致癌作用。ST7-AS1在胃癌組織及細胞系中表達升高，胃癌細胞中敲除ST7-AS1后細胞的增殖、遷移及侵襲能力減弱，細胞凋亡增加，組蛋白甲基轉移酶（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）可與ST7-AS1相互作用，削弱ST7-AS1對癌細胞的遷移及侵襲能力[6]。EOC是卵巢癌最常見的組織學類型，關于ST7-AS1在EOC中的表達情況及具體的致癌機制，相關報道較少。本研究發現，與癌旁正常組織相比，ST7-AS1在EOC組織中呈現高表達，卵巢癌A2780細胞中抑制ST7-AS1表達后，癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力減弱，提示ST7-AS1在EOC中具有致癌作用，其可能通過增強癌細胞的惡性生物學行為促進EOC進展。由于筆者單位能收集到的非EOC的組織樣本較少，本次研究未能檢測ST7-AS1在其他病理類型的卵巢癌中的表達情況，后續筆者將收集足夠的樣本進行相關的研究。

作為內源性非編碼小RNA，miRNA在卵巢癌中表達異常，將有可能作為卵巢癌診斷、預后的預測指標及潛在治療靶點[12]。研究表明，lncRNA可通過競爭性吸附miRNA抑制其表達，導致miRNA介導的靶基因表達失調而在卵巢癌進展中發揮作用[13-14]。有研究發現，環狀RNA circRAB3IP通過吸附miR-580-3p上調TWIST1促進骨肉瘤進展[15]。此外，lncRNA LHFPL3-AS1/miR-580-3p/STAT3軸通過激活JAK2/STAT3信號通路促進黑色素瘤惡性轉移[16]。本研究通過starBase3.0軟件分析預測ST7-AS1與miR-580-3p存在結合位點，由此推測ST7-AS1可能通過吸附miR-580-3p參與卵巢癌進展。本研究表明，miR-580-3p在EOC組織中表達下降，在卵巢癌A2780細胞系中ST7-AS1負性靶控miR-580-3p。通過本研究，筆者認為ST7-AS1可能通過競爭性吸附miR-580-3p介導其下游靶基因表達失衡促進卵巢癌進展。基于該推測，后續筆者將進一步研究探討與miR-580-3p相關的靶基因以分析ST7-AS1在卵巢癌中的具體致癌機制。

綜上所述，LncRNA ST7-AS1在EOC組織中表達升高，抑制ST7-AS1表達可能通過競爭性吸附miR-580-3p致卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲能力減弱。ST7-AS1/miR-580-3p軸可能是EOC潛在的診斷及治療靶點，深入研究ST7-AS1對miR-580-3p的具體調控機制或可進一步闡明卵巢癌的發病機制，為卵巢癌的靶向治療提供新的方向。