通過敲除聚谷氨酸合成基因提高納豆桿菌納豆激酶的生產效率

韓宇星，孟凡強，周立邦，陸兆新

(南京農業大學 食品科學技術學院，江蘇 南京，210095)

血漿中不溶性纖維蛋白和血小板凝結形成的血栓導致多種心血管疾病[1]，嚴重威脅著人們的健康，逐漸成為致死率第一的疾病[2]。目前市場上主流的血栓治療藥物有纖維蛋白溶酶原激活劑(tissue-type plasminogenactivator，t-PA)、鏈激酶(streptokinase，SK)和尿激酶(urokinase，UK)等。但是上述藥物存在半衰期短，價格昂貴等缺點。納豆激酶是從納豆中提取的堿性絲氨酸蛋白酶[3]，它具有良好的溶血栓效果。與市場上的溶栓藥物相比，它具有半衰期較長、成本低廉、特異性強、無副作用、可口服、安全性高等優勢，是一種優良的溶栓藥物替代物。但是，納豆桿菌液體發酵時產生的聚谷氨酸(polygutamic acid，γ-PGA)升高了發酵液黏度，導致納豆激酶的分離純化困難。γ-PGA是由谷氨酸通過肽鍵聚合而成，分子質量在10～1 000 kDa左右[4]，黏度很高，且帶有離子狀態的羧基基團，使得菌體細胞帶有負電荷，使發酵液達到一種穩定狀態。發酵液需要稀釋多倍才能通過離心或者絮凝的方法去除菌體，因此降低γ-PGA 產量和發酵液黏度是提高納豆激酶生產效率的關鍵[5]。

γ-PGA合成酶分為兩類，分別是cap和pgs[6]。如炭疽桿菌的cap基因合成的γ-PGA結合在細胞壁上，作為莢膜的主要成分。而芽孢桿菌中pgs合成的γ-PGA游離在微生物周圍的環境中。pgs基因簇包含3個基因：pgsB、pgsC、pgsA。ASHIUCHI等[7]將含有pgsB、pgsC、pgsA、pgsAB、pgsAC、pgsBC、pgsABC的質粒分別轉化至大腸桿菌，發現只有完整pgsABC基因才能合成出γ-PGA。隨后該研究室構建了pgsBCA基因缺失的枯草芽孢桿菌ISW1214(突變體MA41)[8]，結果表明該枯草芽孢桿菌不能產生γ-PGA[8]，因此pgsB、pgsC和pgsA是γ-PGA合成必要的基因[9]。為提高γ-PGA的產量，研究人員將pgsBCA基因導入至其他的宿主細胞表達γ-PGA，如石峰等[10]、馬婕等[11]將枯草芽孢桿菌中的pgsBCA基因轉化到大腸桿菌中，重組的大腸桿菌也成功的合成出了γ-PGA。而在pgsBCA3個基因中，pgsB基因被認為是構成γ-PGA 合成的最主要催化部分[12]。研究人員研究了對pgsB的蛋白序列，并將其蛋白序列與ATP 酶對比，發現二者的相似度極高，說明pgsB可能具有ATP酶的活性并且可以結合ATP[13]。而對pgsB單獨催化時發現，僅pgsB也可以聚合產生γ-PGA，不過前提是，pgsB的2種狀態需要同時存在[14]。

基于以上的研究，為了提高納豆激酶的分離純化效率，本文擬利用雙交換重組的方法敲除納豆桿菌中γ-PGA合成的關鍵基因pgsB，旨在減少發酵液的黏度，提高納豆激酶的分離純化效率，以期得到一種高效、簡便的納豆激酶工業化提純方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

Bacillusnatto400為本實驗室篩選的納豆激酶高產菌，來源于野生菌株B.natto；大腸桿菌JM109(EscherichiacoliJM109)，北京百斯凱公司；質粒pCBS(溫度敏感型復制子、大腸桿菌中氨芐青霉素抗性、芽孢桿菌中紅霉素抗性)，為本實驗室保存；引物，南京金斯瑞生物技術有限公司，引物序列如表1所示。

表1 敲除和鑒定pgsB基因的引物Table 1 Primers for deletion and identification of pgsB

1.1.2 培養基與試劑

TaqDNA聚合酶、高保真phanta酶、一步克隆試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒，南京諾唯贊公司；氨芐青霉素、紅霉素，Sigma公司。

LB培養基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、氯化鈉5；一級種子培養基(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨10、酵母膏5、氯化鈉10；二級種子培養基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨10、酵母膏5、氯化鈉10，pH 7.2。發酵培養基(g/L)：葡萄糖10、大豆粉40、磷酸氫二鉀1、硫酸鎂0.5、磷酸二氫鈉4、氯化鈣0.2、硫酸錳0.05、消泡劑1；發酵罐補料(g/L)：蔗糖500、葡萄糖50；硼砂緩沖液：50 mmol/L硼砂、150 mmol/L氯化鈉，pH 8.5；纖維蛋白原溶液：72 mg纖維蛋白原溶于硼砂緩沖液；凝血酶：溶于硼砂緩沖液，濃度1 000 U/mL，使用時用硼砂緩沖液稀釋到20 U/mL，-20 ℃保存。磷酸鹽緩沖液(g/L)：磷酸氫二鈉7.2，磷酸二氫鈉2.8，pH 7.2。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR擴增pgsB上游片段和下游片段

以B.natto400 DNA為模板，以pgsB-Up-F和pgsB-Up-R為引物，PCR擴增pgsB基因的上游片段(463 bp)。以pgsB-Dn-F和pgsB-Dn-R為引物，PCR擴增獲pgsB基因的下游片段(473 bp)。PCR的擴增條件為：預變性95 ℃、5 min；變性95 ℃、20 s，退火55 ℃、20 s，延伸72 ℃、30 s，共35個循環，最后72 ℃延伸2 min。膠回收PCR產物，得到分別帶有上下游同源臂的pgsB-up和pgsB-dn。

1.2.2 touchdown PCR 構建pgsB缺失突變基因

采用touchdown PCR的方法將pgsB基因上下游同源臂連接到一起，得到pgsB的缺失突變基因ΔpgsB。以純化后的pgsB-up和pgsB-dn作為模板，以pgsB-Up-F和pgsB-dn-R為引物，進行touchdown PCR。擴增條件為：預變性95 ℃、2 min，變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、15 s，延伸72 ℃、1 min；共5個循環，每次循環退火溫度降低1 ℃；隨后變性95 ℃、15 s，退火55 ℃、15 s，延伸72 ℃、1 min，共30個循環，最后72 ℃延伸2 min。膠回收PCR產物，得到帶有上下游同源臂的pgsB堿基缺失的基因片段ΔpgsB。

1.2.3 構建同源重組雙交換的載體

使用諾唯贊質粒提取試劑盒提取pCBS質粒，并以其為模板，以CBS-BB-R和CBS-BB-F為引物反向PCR擴增獲得載體(8 098 bp)，擴增條件為：預變性95 ℃、1 min，變性95 ℃、20 s，退火55 ℃、20 s，延伸72 ℃、4.5 min，共35個循環；最后72 ℃延伸8 min。膠回收PCR產物，得到pCBS載體。使用諾唯贊一步克隆試劑盒，將ΔpgsB與pCBS載體連接，并轉化至E.coliJM109感受態細胞。在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板篩選陽性轉化子，PCR驗證陽性轉化子，測序驗證后獲得用于pgsB敲除的重組質粒pCBS-ΔpgsB。

1.2.4 納豆桿菌轉化

參照李瑞芳等[15]制備枯草芽孢桿菌超級感受態的方法制備納豆桿菌感受態細胞，參照陸雁等[16]質粒轉化的方法，將15 μL質粒pCBS-ΔpgsB加入到500 μL納豆桿菌感受態中，輕輕搖勻，30 ℃，100 r/min培養30 min，之后再加入600 μL含有5 μg/mL紅霉素的LB培養基，30 ℃，200 r/min繼續培養1.5 h，菌液10 000×g離心30 s，用100 μL上清液重懸菌體，涂布于含10 μg/mL紅霉素的LB固體平板，30 ℃靜置培養12 h。以check-F/R為引物，PCR驗證質粒是否轉化進入納豆桿菌。

1.2.5 藍白斑篩選

將測序驗證后的陽性轉化子在42 ℃下轉接LB培養基培養2次，在含10 μg/mL紅霉素的固體LB平板上涂布40 μL質量濃度為20 mg/mL的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-Gal)溶液，再涂布100 μL的菌液。在42 ℃下培養12 h，4 ℃冷藏8 h后，挑取藍色菌落(單個同源臂重組)。在30 ℃培養12 h后涂布至含X-Gal的LB固體平板上，30 ℃培養12 h，4 ℃冷藏8 h后，挑取白色菌落(2個同源臂重組)，進行PCR驗證并測序。

1.2.6pgsB基因敲除菌株發酵生產納豆激酶

將測序驗證后的B.natto400ΔpgsB株在LB平板上劃線，37 ℃下培養12 h。將單菌落接種于一級種子培養基中，37 ℃、180 r/min搖床中培養12 h。以5%接種量接種于二級種子液中，培養4 h(對數生長中期)。將50 L通氣攪拌式發酵罐滅菌，配制20 L的發酵培養基，采用火焰接種法接種二級種子液(5%接種量)。調節發酵參數：溫度37 ℃、通風比為1∶1、攪拌轉速400 r/min、溶解氧(dissolved oxygen，DO)>20%。通過氨水和10 %磷酸控制發酵液pH 7.2，通過連續補料(補料培養基)的方法控制培養基糖含量在0.5%～1.0%(質量分數)。在該條件下培養24 h之后放罐。

1.2.7 納豆激酶酶活力的測定

在1.4 mL硼砂緩沖液中加入0.4 mL纖維蛋白原溶液，37 ℃孵育5 min。再加入0.1 mL凝血酶，顛倒混勻，37 ℃水浴10 min，使纖維蛋白凝固(模擬血栓)。隨后加入0.1 mL離心后的發酵上清液，顛倒混勻，37 ℃水浴60 min，每20 min顛倒混勻幾次。最后加入0.2 mol/L三氯乙酸，顛倒混勻，終止反應并靜置20 min。12 000×g離心10 min，上清液通過紫外分光光度計測定A275。對照樣品先加入三氯乙酸，再加入待測菌液，酶活力計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Ar為待測樣品的吸光度，AC為對照樣品的吸光度，D為稀釋倍數。

1.2.8 γ-PGA含量的測定

發酵液10 000×g離心20 min，取上清液，加入等體積的無水乙醇，10 000×g離心10 min，棄上清液，烘干后稱量沉淀的重量，該重量即為γ-PGA產量。

1.2.9 發酵液黏度的測定

采用NDJ-9SB型旋轉黏度計對發酵液黏度進行測定。

2 結果與分析

2.1 ΔpgsB片段的構建

以B.natto400的DNA為模板，以pgsB-Up-F、pgsB-Up-R、pgsB-Dn-F、pgsB-Dn-R為引物擴增pgsB上下游同源臂，凝膠電泳檢測結果如圖1所示，在500 bp左右處出現特異性條帶，與理論長度463、473 bp相符。以純化后的上下游同源臂為模板，以pgsB-Up-F、pgsB-Dn-R為引物，采用touchdown PCR的方法構建缺失突變的pgsB片段(ΔpgsB)，結果如圖2所示，在1 000 bp左右處出現特異性條帶，與理論長度918 bp相符，表明ΔpgsB片段構建成功。

M-DS2000 marker；1-目的基因上游片段；2-目的基因下游片段圖1 pgsB上下游同源臂電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of homologous arms of pgsB

M-DS2000 marker；1-突變的pgsB片段圖2 pgsB缺失突變基因(ΔpgsB)電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of pgsB gene with deletion mutation (ΔpgsB)

2.2 重組質粒的構建與鑒定

ΔpgsB基因和載體pCBS通過一步克隆試劑盒連接到一起，隨后轉化至JM109感受態細胞中，涂布至含氨芐青霉素的LB固體培養基上，用引物check-F/R對氨芐青霉素平板上生長的菌落進行菌液PCR篩選，結果如圖3所示。

M-1 000 bp marker；1-重組質粒PCR驗證 圖3 重組質粒pCBS-ΔpgsB電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of recombinant plasmid pCBS-ΔpgsB

2.3 同源重組雙交換

按照諾唯贊質粒提取試劑盒提取重組質粒pCBS-ΔpgsB。并將pCBS-ΔpgsB轉入納豆桿菌感受態細胞內，在含紅霉素的LB固體培養基上篩選，PCR驗證條帶。接著按照1.2.5進行藍白斑篩選，將陽性轉化子在42 ℃條件下轉接2次，在含紅霉素的LB平板篩選藍色菌，在30 ℃培養后，挑取白色菌落，用引物check-F/R進行PCR驗證，結果如圖4所示。在1 000 bp左右處出現特異性條帶，說明ΔpgsB基因已經成功整合到納豆桿菌基因組上，pgsB基因敲除完成。

M-DS2000 marker；1～2-陽性轉化子PCR驗證圖4 納豆桿菌ΔpgsB菌落PCR驗證Fig.4 Colony verification of B.natto ΔpgsB by PCR

2.4 pgsB基因的敲除對γ-PGA產量的影響

2.4.1 在錐形瓶中pgsB基因的敲除對γ-PGA產量及納豆激酶活力的影響

將ΔpgsB株與野生型菌株活化后在搖瓶中發酵，每隔2 h取出1瓶測定其黏度、OD600、γ-PGA含量以及發酵液酶活力。結果表明野生型菌株與ΔpgsB株均在培養10 h左右進入穩定期(圖5-a)。野生型菌株發酵液的黏度在18 h前呈上升趨勢，在18 h左右達到頂峰，隨后快速下降。而ΔpgsB株發酵液的黏度在16 h前呈上升趨勢，在16 h左右達到頂峰，之后緩慢下降。在培養22 h之前，兩者的發酵液在黏度上存在顯著性差異(圖5-b)。野生型菌株發酵液中γ-PGA的含量均顯著的高于ΔpgsB株，在14 h左右野生型菌株γ-PGA的含量達到最大值，為28.536 g/L。而pgsB基因敲除后，γ-PGA含量顯著下降。在14 h 左右γ-PGA含量僅為5.157 g/L，是野生型的18.07%(圖5-c)。兩者的發酵液中納豆激酶活力在24 h之前沒有顯著的差異(圖5-d)。該結果說明，pgsB基因的敲除對菌體生長和納豆激酶的產生并沒有顯著影響，但是γ-PGA含量以及發酵液黏度顯著降低。

a-搖瓶發酵液菌體密度；b-搖瓶發酵液黏度；c-搖瓶發酵液γ-PGA含量；d-搖瓶發酵液酶活力圖5 搖瓶發酵相關參數測定Fig.5 Determination of fermentation parameters in shaking flask注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.4.2 在50 L發酵罐中pgsB基因的敲除對γ-PGA產量及納豆激酶活力的影響

在50 L發酵罐中，野生型菌株在培養18 h時菌體密度達到最高(OD600=24)，隨后緩慢下降。而ΔpgsB株在10 h達到穩定期(OD600=20)，生長速度顯著高于野生菌(圖6-a)。而從黏度曲線來看，ΔpgsB株的發酵液黏度顯著低于野生型菌株發酵液的黏度(圖6-b)。發酵罐中γ-PGA含量的變化趨勢與其在搖瓶中趨勢大致相同，野生型菌株的γ-PGA產量在14 h前不斷上升，在14 h達到最大值28.46 g/L，隨后緩慢下降，而ΔpgsB株的γ-PGA產量較低，在8 h達到最高值15 g/L。發酵24 h后，ΔpgsB株γ-PGA的產量為8.19 g/L，僅為野生型菌株的42.1%(圖6-c)。根據1.2.7的方法，測試ΔpgsB株及野生型納豆桿菌發酵24 h的酶活力，ΔpgsB株的酶活力為23.4 FU/mL，野生型菌株的酶活力為20.3 FU/mL，酶活力提高了15.2 %(圖6-d)，綜上所述，pgsB基因敲除后，納豆桿菌發酵液黏度降低，納豆激酶酶活力提高。

a-發酵罐發酵液菌體密度；b-發酵罐發酵液黏度；c-發酵罐發酵液γ-PGA含量；d-發酵罐發酵液酶活力圖6 發酵罐發酵相關參數測定Fig.6 Determination of fermentation parameters in fermentor.

2.5 pgsB基因的敲除對納豆激酶分離純化的影響

發酵液8 000×g離心20 min后獲得納豆激酶粗酶液，用30 kDa與10 kDa的超濾管對粗酶液超濾，超濾時間為30 min。由于野生型發酵液經過離心后黏度仍然大于ΔpgsB株的發酵液，故超濾效率較低，野生型發酵液的超濾通量為0.1 mL/min，而ΔpgsB株的超濾通量為0.12 mL/min，較野生型提高了20%。此外，野生型經超濾后，酶活力回收率為48.75%，而ΔpgsB株的酶活力回收率為58.97%，比野生株提高了10.22%。所以，pgsB基因的敲除提高了納豆激酶分離純化的效率。

3 討論

納豆激酶的分離純化方法包括超濾法[17]、雙水相分離[18]、柱層析柱[19]、反相膠束萃取法[20]、磁性微球吸附法[21]、集成化分離技術[22]等，但尚未有從分子層面減少發酵液黏度以提高納豆激酶分離效率的報道。本文利用雙交換基因重組技術，敲除了納豆桿菌中γ-PGA的合成基因pgsB。在50 L發酵罐發酵中，相對于野生型納豆芽孢桿菌，ΔpgsB株產生的γ-PGA顯著減少，在發酵24 h時，野生型菌株γ-PGA 的產量為19.46 g/L，而ΔpgsB株的產量僅為8.19 g/L，下降了57.9%。相應的ΔpgsB株發酵液的整體黏度也低于野生型菌株，而納豆激酶酶活力相對于野生型菌株提高了3 FU/mL。原因可能是敲除pgsB基因后，發酵液黏度降低，改善了溶氧條件和營養物質傳遞。此外發酵液黏度下降后，納豆激酶的分離純化也更加的便捷，降低了生產成本，提高了納豆激酶的分離純化效率。

納豆桿菌pgsB基因被敲除后，γ-PGA產量下降，但仍然有γ-PGA合成。研究表明，控制枯草芽孢桿菌合成γ-PGA的基因主要是pgsA、pgsB及pgsC。雖然pgsB的基因被敲除了，但pgsA和pgsC也可能合成γ-PGA。因此后續實驗中將敲除pgsA和pgsC，進一步降低γ-PGA的產量和發酵液的黏度。此外，除了pgsB、pgsA及pgsC，γ-PGA的產生也受多種基因的調控，研究表明在枯草芽孢桿菌中，高濃度磷酸化的DegU對pgsB、pgsC、pgsA的轉錄有促進作用[23]。除了DegU外，高濃度的DegQ也可以調節pgsB的轉錄[24]。所以，要減少γ-PGA的產生，提高分離純化效果，還需要進一步的研究。