基于iTRAQ技術的雞蛋清三種干燥方式差異蛋白質組分析

史勝娟，劉麗莉*，楊協力，張悅琪

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471023)2(食品加工與安全國家級教學示范中心，河南 洛陽，471023)3(河南科技大學 麗正書院，河南 洛陽，471023)

雞蛋清中蛋白質種類非常豐富，每種蛋白的作用對機體的調節有著不同的意義。雞蛋清中富含鐵、鈣、鋅、鉀和磷等礦物質對人體的健康起到關鍵作用。另外，雞蛋清蛋白具有的多種加工特性也非常有益于食品生產[1]。隨著食品工業的快速發展，蛋清蛋白被廣泛應用于食品行業。因此，了解雞蛋清中蛋白質的表達水平、分布情況、結構和功能對于解釋雞蛋中一些成分的功能性質和生物學性質是必要的，同時也為雞蛋的深加工和利用提供理論依據和參考[2]。

近年來，蛋白質組學發展迅速，其研究方法主要是通過組學技術分離蛋白質，然后進行蛋白的質譜鑒定，從而研究蛋白在不同過程中的表達變化。有關蛋清蛋白質組學的研究國內外已有相關的報道。郝麗芳[3]采用凝膠電泳技術對貯藏期間雞蛋黃中蛋白質豐度及種類的變化情況進行探究。牛春宇等[4]綜述了幾種常用于乳酸菌分離鑒定及功能研究領域的組學技術，闡述了多組學技術在乳酸菌功能及其機制研究中的應用概況，進一步為探明乳酸菌的潛在功能提供可行的技術方法和方向。馬靜等[5]整理了現階段蛋白質組學技術發展情況、牦牛乳蛋白質組成及蛋白質組學技術在牦牛乳研究中的應用并進行論述。QIU等[6]對運用組學的方法研究了雞蛋在不同貯存溫度下蛋清蛋白質組的差異，采用二維電泳和軟電離生物質譜相結合的方法，鑒定出了代表8種蛋白的32個蛋白點，在不同溫度下保存時，其豐度存在顯著差異。LIU等[7]利用組合肽配體庫、雙向凝膠電泳技術對胚胎快速生長期蛋清蛋白中低豐度蛋白的整體變化進行比較分析，研究發現在16 d的孵育過程中，發現了88個蛋白點的相對豐度顯著差異(P≤0.05)，其中47個蛋白點對應于來自8個蛋白家族的10個蛋白。LU等[8]研究發現在山羊初乳與常乳中乳脂肪球膜存在差異蛋白，并在這些乳脂肪球膜蛋白中發現有長期抑郁蛋白。KIM等[9]在飼糧中添加皮質酮考察對雞蛋清蛋白豐度的差異和蛋白質含量的影響，結果發現皮質酮治療導致采食量增加和產蛋量降低(P≤0.05)。應激第14天，大蛋雞的mRNAs和蛋白表達也受到顯著調控(P≤0.05)。以上國內外相關研究都是運用組學相關技術對不同處理組之間蛋白質在組成成分、表達水平及各蛋白質之間的作用進行分析整理。本課題組前期采用iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術對噴霧干燥(spray-drying，SD)處理的蛋清蛋白進行鑒定和生物信息學分析，探討蛋清蛋白在不同干燥入口溫度下差異蛋白質的分布、功能及作用機制[10]。然而目前還缺乏基于蛋白質組學的方法來探究不同干燥方式中蛋白質變化的研究報道。

本研究以真空冷凍干燥(vacuum freeze-drying，FD)、SD和微波真空冷凍干燥(microwave vacuum freeze-drying，MFD)3種干燥方式處理后的蛋清蛋白為研究對象，利用iTRAQ定量技術構建出蛋清蛋白干燥過程中的表達圖譜，對比3種干燥方式蛋清蛋白質組學的變化，并對各時間點鑒定出的差異蛋白進行生物學分析，旨在更好地了解不同干燥方式下蛋清蛋白的差異變化并篩選出影響較大的功能性蛋白，為進一步開發高品質的功能性蛋清粉提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋，河南洛陽盛德美超市；氨水、IAM碘乙酰胺、三乙胺-碳酸緩沖溶液(triethylammonium bicarbonate buffer，TEAB)，美國Sigma公司；丙酮、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，上海國藥公司；考馬斯亮藍染色液(常規法)，Beyotime公司；iTRAQ 8PLEX，美國AB SCIEX公司；Modified Trypsin蛋白酶(質譜級)，PROMEGA公司；PierceTMBCA蛋白檢測試劑盒、蛋白Marker、蛋白酶抑制劑、Bond-BreakerTMTCEP溶液、水、乙腈、甲醇、甲酸、異丙醇，均為色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設備

Xo-1800D型超聲波細胞破碎儀，上海般諾生物科技有限公司；EPS-300型數顯式穩壓穩流電泳儀，上海納識生物科技有限公司；UltiMate 3000高效液相色譜儀、串聯質譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；Tecan Infinite F50酶標儀，北京博宇騰輝科貿有限公司；LNG-T98B型冷凍離心濃縮干燥器，太倉市華利達實驗設備有限公司；ATX124R型分析天平，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

蛋清粉：清洗鮮雞蛋表面的污漬并進行消毒，晾干后分離蛋清蛋黃，攪拌蛋清液后室溫下自然發酵48 h進行脫糖，巴氏殺菌法殺菌后分別采用SD、FD、MFD 3種方式進行干燥處理，具體參照本課題組前期實驗方法[11]。

1.3.2 總蛋白質的提取

冷凍狀態下取出適量樣品置于冰上，加入蛋白質裂解液[8 mol/L尿素，1%SDS(質量分數)，含蛋白酶抑制劑]進行超聲溶解2 min，然后在裂解20 min，12 000×g4 ℃ 離心30 min，取蛋白質上清液用于定量。

1.3.3 蛋清蛋白酶解和肽段iTRAQ標記

取蛋白樣品100 μg，按照酶與蛋白質量比為1∶50加入胰蛋白酶，在37 ℃條件下酶解10 h。用真空泵抽干肽段，然后用0.5 mol/L TEAB溶解肽段。從冰箱取出iTRAQ試劑盒待其恢復至25 ℃時對肽段進行標記。為了使實驗結果更加清晰用不同的iTRAQ標簽對肽段進行標記，在室溫下放置60 min。最后把標記好的各組肽段進行混合，進行高效液相色譜分離，流速為200 μL/min，梯度為47 min。

1.3.4 蛋白質組數據分析

所有數據均采用Max Quant Software Reversion 1.5.3.8進行收集和量化。對于蛋白質分類，使用在線PANTHER庫。為了在蛋清蛋白中發現過度表達的基因本體論，啟動PANTHER過度表達試驗，用Bonferroni校正對G.gallus(數據庫中的所有基因)參考列表和注釋數據集進行多次試驗，利用在線BLAST2GO在線數據分析軟件完成基因本體(gene ontology，GO)功能分析，利用在線KOBA分析軟件完成KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析。

2 結果與分析

2.1 三種干燥方式蛋清粉中蛋白質鑒定結果及統計分析

通過對所獲得的蛋白信息和數據庫結果進行對比，在3種干燥方式過程中共鑒定出157個蛋白。經分析得出這些蛋白質的肽段長度主要在7～24個氨基酸，屬于正常范圍可用于后續的實驗分析。對鑒定到的蛋白質進行相對分子質量統計，結果表明，有89%蛋白質相對分子質量在1～120 kDa。按照表達倍數變化1.2倍以上的標準篩選差異表達蛋白質，表達倍數變化大于1.2倍表現為上調，表達倍數變化小于0.83倍表現為下調。由此篩選出差異蛋白質的結果如表1、圖1所示，最終獲得的差異蛋白總數為87個，其中MFD vs FD組上調蛋白質數量為46個，占差異蛋白質總數的67.6%。

表1 差異蛋白質篩選結果統計 單位：個

圖1 SD vs FD、MFD vs FD和MFD vs SD蛋清蛋白粉韋恩圖Fig.1 Vennn diagrams of egg white protein in powder at SD vs FD、MFD vs FD和MFD vs SD

2.2 差異表達蛋白質聚類分析

通過對SD vs FD，MFD vs FD和MFD vs SD 3組的87個差異蛋白進行層次聚類分析，以揭示蛋白質變化的模式[12]，如圖2所示。這些不同干燥方式處理的蛋清差異蛋白中，角蛋白，II型細胞骨架(ID號：NP_990263.1)、角蛋白，I型細胞骨架(ID號：NP_990340.2)、谷氨肽酶(ID號：XP_426327.3)均在SD處理中表現出高表達水平。角蛋白含有較多的胱氨酸，二硫鍵含量很多，在蛋白質肽鏈中起交聯作用，因此角蛋白化學性質特別穩定，有較高的機械強度。此外，角蛋白中還含有豐富的谷氨酸、天冬氨酸等鮮味氨基酸，可以用來制作新型食品添加劑應用到食品加工業中。胰島素樣生長因子結合蛋白7(ID號：XP_420577.4)、黏蛋白-6(ID號：XP_015142236.2)、可溶性鈣活化核苷酸酶1亞型(ID號：XP_015150907.1)均在FD處理中表現出高表達水平。胰島素樣生長因子結合蛋白是一組具有促生長作用的多肽類物質。跨膜蛋白酶絲氨酸9亞型(ID號：XP_425880.4)、載脂蛋白D前體(ID號：NP_001011692.1)、低品質蛋白:動力蛋白重鏈5(ID號：XP_025003476.1)、前神經肽Y前體(ID號：NP_990804.1)、二-N-乙酰殼多糖酶(ID號：XP_422372.1)均在MFD處理中表現出高表達水平。跨膜蛋白酶絲氨酸可以斷裂大分子蛋白質中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質。蛋清中這些高表達量蛋白的發現能夠為選擇合適的方式干燥出高品質的功能性蛋清粉提供重要信息。此外，在MFD vs FD組中差異蛋白數量較多，可能是因為蛋清蛋白經微波輻照后結構和理化性質改變，進而引起其功能性質改變。課題組前期[13]研究表明，MFD工藝會對雞蛋清蛋白的結構和功能特性造成一定的影響。

圖2 差異表達蛋白質聚類分析結果Fig.2 Results of cluster analysis of differentially expressed proteins

2.3 差異表達蛋白GO功能富集分析

GO是一個標準化的基因功能分類體系，它分別從3個方面對蛋白質功能進行分類，分別為分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)、細胞組成(cellular component,CC)[14]。SD vs FD、MFD vs FD和MFD vs SD 3組蛋清蛋白共鑒定87個差異蛋白，利用BLAST2GO軟件對差異表達蛋白進行GO富集分析，結果如圖3、表2所示，3組比較組中，參與的BP主要涉及單體細胞過程、生物調節(biological regulation)、代謝過程、生物過程調節，說明不同的干燥方式對雞蛋清細胞內蛋白質的代謝影響很大。CC主要分布在胞外區、細胞、細胞器、細胞部分、胞外區部分。其參與的蛋白質數較多顯著過度表達，說明了蛋清對細胞的保護作用[15]。差異倍數最高的為黏蛋白(蛋白ID：XP_025007106.1)，差異倍數為2.619。黏蛋白是一族高分子質量、重糖基化的蛋白，與蛋清的凝膠性質密切相關[16]，是蛋清凝膠狀結構的重要成分[17]。MF主要包括結合和催化活性。由此表明3種干燥方式會造成生物過程、細胞組成及分子功能等方面的基因功能發生變化。郭長明等[18]利用蛋白組學技術對魚源株與人源株差異表達蛋白進行GO功能分析，結果發現，差異蛋白共涉及26個生物學功能。LIAO等[19]利用GO功能注釋分析了不同泌乳期人乳乳清差異蛋白主要參與了信號傳導、細胞外組成、代謝等過程。通過GO功能分析找到差異基因富集在哪些類別條目上，尋找引起基因功能改變的差異基因，對實驗結果有指導作用。

圖3 GO功能富集分析Fig.3 GO function enrichment analysis

表2 差異蛋白的GO術語和途徑Table 2 GO terms and pathways for differential proteins

2.4 差異表達蛋白KEGG通路富集分析

KEGG是常用的代謝和信號轉導通路研究數據庫之一[20]。利用Python軟件生成Pathway富集分析柱形圖。如圖4～圖6所示，利用KEGG數據庫對MFD vs FD組差異表達蛋白進行注釋，結果顯示，富集最為顯著的為折疊和降解、運輸和分解代謝、細胞生長和死亡，接下來分別為細胞活性、脂質代謝、聚糖的生物合成和代謝、信號傳導、細胞群落、輔助因子和維生素的代謝、核苷酸代謝、內分泌系統、傳染病。利用KEGG數據庫對SD vs FD組差異表達蛋白進行注釋，結果顯示，富集通路為聚糖的生物合成和代謝、細胞活性、運輸和分解代謝、核苷酸代謝。利用KEGG數據庫對MFD vs SD組差異表達蛋白進行注釋，結果顯示，富集最為顯著的為折疊和降解、運輸和分解代謝，接下來分別為細胞生長和死亡、脂質代謝、轉錄、信號傳導、翻譯內分泌系統。彭夢玲等[21]和馬聰聰等[22]同樣利用KEGG數據庫對差異蛋白進行注釋，找到了差異基因顯著性變化的生物學調控通路。

圖4 MFD vs FD差異蛋白的KEGG通路圖Fig.4 KEGG pathway analysis of MFD vs FD differential proteins

圖5 SD vs FD差異蛋白的KEGG通路圖Fig.5 KEGG pathway analysis of SD vs FD differential proteins

圖6 MFD vs SD差異蛋白的KEGG通路圖Fig.6 KEGG pathway analysis of MFD vs SD differential proteins

2.5 差異表達蛋白質網絡互作分析

在機體中，蛋白質通過結合作用和相互作用進行彼此之間的信號傳遞和功能之間的相互調節。本研究將不同干燥方式下(SD、FD、MFD)的差異蛋白進行蛋白質網絡互作分析，圖7為MFD vs FD、SD vs FD、MFD vs SD共同差異表達蛋白的互作圖。與蛋白關聯的線條數量越多，表明該蛋白在網絡中越關鍵。其中具有高連接度的為血清白蛋白前體、凝血酶原前體、組織蛋白酶L1前體。血清白蛋白分子質量較低，溶于水，易結晶，在中性溶液中加熱即凝固，是具有黏性和膠質性的物質，在現代食品加工業中常作為防腐劑和保健劑。這些高連接度的雞蛋清差異蛋白很可能是調節整個系統代謝和信號傳導途徑的關鍵節點，具有非常重要的作用。

圖7 蛋白互作網絡圖Fig.7 Protein interaction network

2.6 指示蛋白的篩選

MFD vs FD、SD vs FD、MFD vs SD 3組間共有的87個差異表達蛋白，從差異蛋白篩選出與蛋清蛋白密切相關的指示蛋白。由圖8可知，有4種蛋白質在不同的干燥過程中豐度變化顯著，分別是黏蛋白(XP_025007106.1)、血清白蛋白(NP_990592.2)、卵清蛋白相關蛋白Y亞型X1(XP_015137657.1)和卵白蛋白相關蛋白Y(NP_001026172.1)。豐度變化顯著的原因可能是不同的干燥方式對蛋清蛋白的結構和理化性質有不同程度的影響，從而造成蛋白之間的差異，這符合本課題組前期研究發現結果[11]。

a-黏蛋白(XP_025007106.1)；b-血清白蛋白(NP_990592.2)；c-卵清蛋白相關蛋白Y亞型X1(XP_015137657.1)；d-卵白蛋白相關蛋白Y(NP_001026172.1)圖8 二級質譜圖Fig.8 Secondary mass spectrum

2.6.1 黏蛋白

黏蛋白在雞蛋蛋白質中變性原性較強[23]，其結構緊密有耐熱耐酸堿等特性。黏蛋白是形成凝膠的關鍵蛋白，其含量與蛋清凝膠黏彈性呈正相關，對蛋清凝膠狀結構影響顯著。并且黏蛋白耐蛋白水解，具有維持重要黏膜障礙的作用[24]。

2.6.2 血清白蛋白

血清白蛋白在人體血漿蛋白質中占比較大，是一種溶解度大，親水性強，功能較多的蛋白。它可以和一些難溶的物質結合形成易溶性的復合物。因運輸類固醇膽色素、氨基酸等物質具有運輸作用，它是反映肝臟合成功能的重要指標，能夠維持人體血液中正常的滲透壓水平。

2.6.3 卵清蛋白相關蛋白Y亞型X1

卵清蛋白相關蛋白Y亞型X1是卵清蛋白中的一種，也是蛋清中的主要組成成分，其結構與性質發生變化會引起功能性質的改變，采用不同干燥技術和手段一定程度上影響其抗氧化性、持水性、乳化性等功能性質。LIU等[25]探究了SD和MFD對水解/糖基化卵清蛋白制備的影響，研究發現經MFD處理的水解/糖基化卵清蛋白在起泡性、乳化穩定性和熱穩定性均優于SD。因此探究卵清蛋白經干燥處理后是否會引起蛋清蛋白在加工過程中功能性質的改變可為實際生產提供重要的參考價值。

2.6.4 卵白蛋白相關蛋白Y

卵白蛋白相關蛋白Y屬于卵白蛋白中的一種，對蛋清液的起泡性和乳化性有很大影響，因此，制備蛋清粉時，加工方式的選擇對卵白蛋白的品質尤為重要。李俐鑫等[26]有關研究表明卵白蛋白的某些功能特性如凝膠性、黏性等易受外部因素的影響，因此，在食品加工過程中要注意調整因素的水平以確保達到理想的加工條件。此外，還有相關研究表明卵白蛋白與多糖復合后可以提高其凝膠性質[27]。

雞蛋清在3種不同的干燥方式過程中，以上4種蛋白豐度發生顯著變化，很可能是在不同的干燥方式下，不同的加熱溫度和加熱時間會造成蛋白質結構發生變化，進而引起蛋白的功能性質發生改變。其具體原因有待進一步驗證。

3 結論

本研究利用iTRAQ蛋白質組學先進技術，對FD、SD、MFD的蛋清蛋白的組成及豐度差異進行了鑒定和分析。在157種鑒定的具有定量信息的蛋清蛋白中，發現了87種差異豐度蛋清蛋白。不同的干燥方式相比，MFD vs FD組比SD vs FD組差異蛋白數目多52.94%，說明干燥方式會對蛋清蛋白豐度差異產生較大影響。通過功能注釋、蛋白質網絡互作等生物信息學分析發現，差異蛋白主要參與的生物過程為單體細胞過程，主要參與的分子功能為蛋白結合，主要參與的細胞組成為胞外區。

在不同的干燥方式蛋清蛋白差異蛋白質組中發現有4個蛋白質變化較為明顯，分別為黏蛋白、血清白蛋白、卵清蛋白相關蛋白Y亞型X1和卵白蛋白相關蛋白Y，在功能注釋、差異倍數和蛋白質互作中變化顯著。這4個差異蛋白質均有望作為蛋清蛋白干燥過程中的指示蛋白。本研究對3種干燥方式的蛋清蛋白豐度差異進行了深入研究，找到了重要的功能性蛋白，這些蛋白的發現能夠為日后生產及優化功能性蛋制品提供理論依據。