基于線粒體全基因組結構的鯧屬魚類分子分類研究

閆永斌，程起群

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306）

鯧屬（Pampus）魚類隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes），鱸 形 目（Perciformes），鯧 科（Stromateidae），是世界上，特別是印度太平洋海域 的 重 要 海 洋 經 濟 魚 類［1］。1758年，LINNAEUS［2］建立鯧屬（原屬名Stromateus），將鯧魚定名為Stromateusfiatola，于是在最初階段，是以Stromateus作為鯧屬的屬名；后經FOWLER［3］更正，將鯧屬改名為Pampus，此后，Pampus作為鯧屬屬名一直被沿用至今［3-4］

自鯧屬建立以來，其分類問題一直存在不同的觀點，至今尚未統一。研究初期主要依據形態特征進行分類，依次經歷了“兩種說”、“三種說”、“五種說”、“六種說”和“八種說”。例如REGAN［5］依據尾鰭形態特征將鯧屬分為兩個種：即尾鰭為截形或淺叉形的中國鯧（P.chinensis）和尾鰭深叉形、下葉延長的灰鯧（P.cinereus）。HAEDRICH［6］根據鰭的形態、鰭條鰭棘數目、脊椎骨數目、鰓耙數目等特征，將鯧屬分為3個種，即：中國鯧、銀鯧（P.argenteus）和高麗鯧（P.echinogaster），并視灰鯧為銀鯧的同物異名。成慶泰和鄭葆珊［7］根據鰭和吻的形態特征，將中國沿海鯧屬魚類分為3個種：燕尾鯧（P.nozawae）、銀鯧和中國鯧；鄧思明等［8］依據側線管系統、骨骼系統、耳石結構及食道側囊特征，朱元鼎［9］基于鰭的形態和顏色、頭部后上方側線管的形態特征以及脊椎骨數目，也都將鯧屬分為3種，即銀鯧、灰鯧和中國鯧。后LIU和LI［10］根據最大體長、鰭的形狀、耳石和脊椎骨數等形態特征發表了鯧屬魚類一新種——珍鯧（P.minor），并根據鰓耙、幽門盲囊、耳石、側線管、頭顱、脊椎骨等形態特征，進一步將中國沿海鯧屬魚類分為5個種，即銀鯧、翎鯧（P.punctatissimus）、灰鯧、中國鯧和珍鯧［4］。2013年，LIU和LI［11］又報道了分布于中國東南沿海鯧科鯧屬的一新種——劉氏鯧（P.liuorum），該魚從吻的形狀、鰓耙的數量和形狀、脊椎骨數、胸鰭比例和眼徑大小等方面與其他鯧魚區別開來，認為這是鯧屬的第6個種，但其有效性存疑［12-13］。而JAWAD和JIG［1］通過研究鯧屬魚類軸向骨架的7個骨骼特征，將鯧屬分為8個種：銀鯧、鐮鯧、翎鯧、灰鯧、中國鯧、珍鯧、劉氏鯧和燕尾鯧。

隨著分子生物學技術的發展，分子標記也被用于物種鑒別，CUI等［14］利用線粒體16S rRNA和COI基因的部分序列，將鯧屬分為5個物種：中國鯧、灰鯧、珍鯧、翎鯧和未定名新種（Pampussp.）。YIN等［12］根據核基因標記將鯧屬分為中國鯧、灰鯧、銀鯧、翎鯧和珍鯧。李淵［15］基于形態和DNA條形碼的綜合分析，認為鯧屬魚類有6種，即銀鯧、鐮鯧、翎鯧、灰鯧、中國鯧和珍鯧；并認為前人所研究的分布于黃海、東海和渤海的“銀鯧”實際上是鐮鯧，而真正的銀鯧分布于臺灣海峽以南。

總體而言，鯧屬魚類分類存在以下問題：1）鯧屬魚類存在幾個有效物種？2）銀鯧與鐮鯧的分類關系如何？3）灰鯧和翎鯧是否為同一物種？4）缺乏有效的鯧屬魚類種間的分子鑒別標記。

線粒體基因組目前已被廣泛應用于系統發育及物種間鑒別研究，因為它比核DNA進化速率快，導致其在近緣種間的差異較大，易于識別［16］。線粒體基因組的大小通常在15～20 kb，一般包含2個核糖體RNA基因（ribosomal RNAs，rRNAs），13個蛋白質編碼基因（protein-coding genes，PCGs），22個轉移RNA基因（transfer RNAs，tRNAs）和非編碼控制區（control region，CR或D-loop）［17］。其中，RNA基因進化速率最慢，D-loop區最快，而細胞色素b（cytochrome b，Cytb）和NADH脫氫酶亞基（NADH dehydrogenase subunit，ND）基因進化速率適中［18-20］，16S核糖體RNA基因（16S rRNA）和細胞色素C氧化酶第一亞基（cytochrome c oxidase subunit I，COI）基因標記常被用作DNA條形碼，用于鑒定形態相似的近緣種。DNA條形碼（DNA barcoding）是一段短的、標準化的DNA序列，于2003年被HEBERT首次提出，由于其既具有穩定的種內保守性，又包含足夠的種間遺傳變異而被用于物種的分子鑒定［21］。

本研究測定了鯧屬魚類5個物種的線粒體全基因組序列，并結合NCBI數據庫中已有的鯧屬魚類線粒體全基因組序列，進行綜合分析，以期為解決鯧屬魚類分類學、進化遺傳學及種間鑒別上的問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及組織DNA提取

采集5種鯧屬魚類樣本（銀鯧、灰鯧、翎鯧、中國鯧和珍鯧），樣本信息見表1。所有樣本均按照形態和解剖學特征進行分類［4，7，22］。每個樣本分別取其肌肉組織，采用常規的苯酚-氯仿法提取基因組DNA，并于-20℃保存備用。

表1 實驗所用的樣本信息Tab.1 Information of samples used in this study

1.2 引物設計及PCR擴增、測序

依據NCBI已公布的鯧屬魚類線粒體全基因組序列（序列登錄號見表2），應用軟件Primer Premier 5.0設計特異性引物，所有特異性引物均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

除珍鯧的ZC06和ZC08引物外，其余所有引物的PCR擴增體系為：12.5μL 2×PCRTaqPCR Master Mix，10μmol·L-1的引物各1μL，20 ng·μL-1的DNA模板1μL，最后加雙蒸水至混合液總體積為25μL。反應條件：在94℃時預變性5 min；然后循環35次，每一個循環包含94℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸60 s；最后在72℃下延伸8 min。

珍鯧的引物ZC06和ZC08由于其擴增產物片段過長（分別為5 641 bp和3 292 bp），采用長PCR擴增。擴增體系為2.5μL 10×Long PCR buffer with 15mM MgCl2，2.5 mmol·L-1的dNTP Mix 2μL，5 U·μL-1的Long PCR Enzyme Mix 0.25μL，10μmol·L-1的引物各1μL，20 ng·μL-1的DNA模板1μL，最后加雙蒸水直至混合液的總體積為25μL。反應程序為：在94℃時預變性2 min；然后循環35次，每一個循環包含94℃變性45 s，60℃退火50 s，68℃延伸4～8 min；最后在68℃下延伸10 min。

在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，并在復日FR980凝膠電泳成像系統中拍照來檢測PCR擴增產物的質量。將PCR擴增產物純化后，送上海桑尼生物技術有限公司雙向測序。

1.3 數據處理

利用DNASTAR、CHROMAS、MEGA等軟件，對測序結果進行拼接、注釋，獲得鯧屬魚類完整的線粒體全基因組序列，并提交至GenBank（序列登錄號見表2）；確定線粒體基因組上13個PCG、2個rRNA基因以及D-loop區的相應位置［23-24］，通過tRNAscan-SE 1.21［25］確定大部分tRNA基因，其他不能確定的tRNA基因通過相關tRNA的二級結構圖及反密碼子來確定［26-27］。

表2 鯧屬魚類引物設計模板序列及所測序列NCBI登錄號Tab.2 Accession numbers of templates and sequencing sequences

1.4 序列分析

1.4.1 線粒體全基因組特征

目前NCBI網站中只有6種鯧屬魚類的線粒體全基因組序列，即銀鯧、灰鯧、翎鯧、中國鯧、珍鯧和鐮鯧，本研究測定了除鐮鯧外其余5種鯧魚的線粒體全基因組序列，因此下載鐮鯧線粒體全基因組序列（GenBank登錄號NC_023258），用于綜合分析鯧屬魚類線粒體全基因組序列特征及差異。

利用MEGA［28］軟件分析每個物種線粒體基因組全序列的長度、結構和基因排布；以及每個基因位點的變異率、遺傳距離和堿基含量等信息。

1.4.2 控制區結構及特征分析

對于6種鯧魚的控制區（D-loop）序列，參考前人的方法，尋找控制區序列特有結構并進行結構描述［29］和串聯重復篩選［30］。

1.4.3 置信度分析

從NCBI網站下載所有已命名的鯧屬魚類線粒體全基因組序列，分別提取其PCG序列進行置信度分析。利用MEGA中的鄰接法（neighborjoining，NJ），以Kimura 2-parameter（K-2-P）模型構建系統發育樹（bootstrap=1 000），評估PCG標記對鯧屬魚類系統進化分析的適用性［31］。該方法主要依據構建NJ樹的過程中bootstrap獲取的置信度高低判斷系統樹的可靠性，計算得到單一序列構建系統樹的置信度和以及堿基信息量（置信度和／序列長度），比較分析基因組的不同區域在系統進化分析中的適用性。

1.4.4 DNA條形碼分析

根據置信度以及線粒體每個基因位點變異率的結果，選取適合的基因標記進行DNA微型條形碼（mini-barcodes）分析［32］。在NCBI網站下載鯧屬魚類相應基因的剩余序列，增加分析結果的可靠性，共獲得18條序列（表3）。將所有序列進行比對，篩選合適的同源序列片段進行DNA條形碼分析，并將該片段從5′端到3′端平均分成3或6個小片段，即總共9塊區域，進行微型條形碼分析。微型條形碼的篩選參考RASMUSSEN等［32］的標準：1）原始條形碼序列長度必須大于500 bp；2）微型條形碼序列中不能有間斷點。

表3 鯧屬魚類DNA條形碼分析序列Tab.3 Sequences of Pampus fishes used for DNA barcode analysis

利用DAMBE軟件［33］對DNA條形碼進行替換飽和性檢驗，使用MEGA軟件［28］進行以下分析：對序列進行比對；計算條形碼的堿基組成、保守位點數、變異位點數、簡約信息位點數、轉換（transition）和顛換（transversion）頻率的比值；基于各候選條形碼，計算鯧屬魚類各物種種間和種內遺傳距離，比較種間和種內遺傳距離，篩選出可用于區分鯧屬魚類的最適DNA條形碼。

1.4.5 系統發育分析

利用MEGA軟件［28］，選擇刺鯧屬魚類刺鯧（Psenopsisanomala）作為外群，利用線粒體全基因組以及所篩選的DNA條形碼對鯧屬魚類進行系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 線粒體全基因組基本特征

6種鯧屬魚類的線粒體全基因組全長在16 551 bp到18 062 bp之間，都含有2個rRNA基因（16SrRNA和12SrRNA）和13個PCGs。灰鯧、翎鯧和中國鯧分別含有22個tRNA基因，而銀鯧、鐮鯧和珍鯧分別含有23個tRNA基因（銀鯧和鐮鯧多了1個tRNAMet，珍鯧多了1個tRNAPro）。同時，在線粒體全基因組組成上，珍鯧有2個D-loop區，而其余5種魚分別只有1個Dloop區。銀鯧、鐮鯧、灰鯧、翎鯧和中國鯧的線粒體基因組結構和分布特征大體是一致的，基本符合硬骨魚線粒體基因組結構和分布特征，而珍鯧在16SrRNA-tRNAIle區域發生了ND1的重排，并且出現了額外的tRNAPro和D-loop區。

由表4可以看出，6條線粒體全基因組序列（不含D-loop區）經比對獲得一致序列長度為11 901 bp，其中變異位點3 950個，占所有位點數的33.2%，發生轉換1 311次，顛換602次，轉換顛換比為2.2。

鯧屬魚類線粒體基因組序列、PCGs序列以及tRNA拼接序列的G含量均比其他堿基低，表現出明顯的堿基偏好性，但是rRNA序列中T的含量小于或等于G的含量。13個PCGs中，ATP8的變異程度和遺傳距離最大（分別為43.5%、0.305），其次是ATP6（43.1%、0.303），變異程度和遺傳距離最小的是ND4L（21.2%、0.119）。rRNA和tRNA均表現出較小的變異程度和遺傳距離，尤其是tRNA拼接序列，變異程度（12.9%）和遺傳距離（0.067）在所有基因中最低（表4）。

表4 鯧屬魚類線粒體基因組及不同區域的保守序列長度、變異位點數（比例）、遺傳距離和堿基組成Tab.4 Length of consensus sequences，number of variable sites，genetic distances and base composition of mitochondrial genomes of different regions of 6 Pampus fishes

2.2 控制區結構及特征

鯧屬魚類的D-loop區位于tRNAPro和tRNAPhe基因序列之間（本研究珍鯧有一重復D-loop區序列在tRNAPro和tRNALeu之間），確定長度為831～1 928 bp。銀鯧、鐮鯧含有1個終止序列區（TAS），而中國鯧與珍鯧有2個終止序列區（TAS），翎鯧和灰鯧有3個終止序列區（TAS）。6種鯧魚都含有1個中央保守結構域（CSB-D，E，F），除珍鯧外都具有3個保守序列塊CSB1、CSB2、CSB3。

銀鯧D-loop區包括5個含有CSB3和啟動子的串聯重復序列（715～1 328），而鐮鯧D-loop區包括10個含有CSB3的串聯重復序列（719～1 924），灰鯧與翎鯧D-loop區的串聯重復片段完全一致，都具有兩種片段，分別在位點19～59、37～78之間，重復片段的前兩段完全一致，最后一段由于核苷酸的缺失而不完整。中國鯧D-loop區包含一種重復序列，在位點17～60之間。珍鯧D-loop區無重復序列。

2.3 置信度分析

在13個PCGs中，由于ND6基因的堿基組成與其他基因存在明顯差異且在系統發育建樹分析中的效果較差［34］，因此暫不考慮，其余基因結果見表5，由表5可知，對于COXII、ATP8、ATP 6、ND4L等基因，雖然單堿基的信息量較高，但置信度和較低，無法形成可靠的系統發育樹，所以也暫不考慮。除這些基因外，置信度和最高的是COXI基因（N=985），隨后是ND1、ND3、COX III、ND2基因，單堿基信息量最大的是ND3基因（N／L=2.7192），隨后4個是COXIII、ND1、ND2、COXI基因。綜合考慮，對于鯧屬魚類的系統進化分析，線粒體蛋白質編碼基因的適用情況為：最好的是ND3和COXIII，其次是ND1和ND2，較差的是COXII、ATP8、ATP6、ND4L、ND5，其他基因表現一般。

表5 鯧屬線粒體蛋白質編碼基因組構建的NJ樹的置信度分析Tab.5 Bootstrap values analysis of NJ trees built based on different regions in mitochondrial genomes of Pampus fishes

2.4 DNA條形碼分析

根據基因標記變異率和置信度分析結果，綜合考慮，選取ND2基因作為DNA條形碼對鯧屬魚類進行分析鑒定。將18條基因序列通過Clustal W［23］方法進行多重序列比對，最終選取了一段長為633 bp的同源序列作為完整條形碼進行分析，如表6所示，這段序列中，腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）的平均含量分別為30.6%、27.5%、29.1%、12.7%，A+T明顯大于C+G，這符合后生動物線粒體基因堿基組成偏移性的特點［16］。3個密碼子中A+T的含量差別較大，其中第三位點的A+T含量最高，達到66.1%，第一、第二位點的A+T含量分別為51.1%、57.2%。

表6 鯧屬魚類ND2序列堿基分布頻率Tab.6 Nucleotide frequencies of ND2 sequences in Pampus fishes

條形碼序列的核苷酸變異分析見表7，如表7所示，這633個位點中分別有416個保守位點（conserved sites）、217個變異位點（variable sites）和211個簡約信息位點（parsimony informative sites）。變異位點和簡約信息位點主要集中在序列的第三位點上，分別占兩者總和的65.9%和65.4%，而第一和第二位點較保守。

表7 鯧屬魚類ND2序列核苷酸變異情況Tab.7 Sequence variation of ND2 gene in Pampus fishes

DAMBE軟件［33］對DNA條形碼序列進行替換飽和性檢驗，結果顯示，序列未飽和，可進行建樹分析。建樹分析結果見圖1，由圖1可知，鯧屬魚類系統發育樹的聚類十分混亂，可能是由于NCBI網站上的序列被錯誤的鑒別導致，并且灰鯧沒有形成明顯的分支，因此本實驗將混亂的序列進行重新分類，暫將其假設為其他物種，以便進行后續分析，假設的序列見表8。

表8 假設序列Tab.8 Hypothetical sequence

圖1 基于ND2基因片段采用NJ法構建的鯧屬系統進化樹Fig.1 Phylogenetic relationship tree of Pampus fishes built based on partial sequences of ND2 gene by using neighbor-joining method

將完整條形碼5′端到3′端平均分成3或6個小片段，每個片段長為211 bp或105 bp，總共9個微型條形碼區域。通過MEGA軟件，采用K-2-P模型計算各條形碼對應的平均種內遺傳距離和平均種間遺傳距離。由表9可知，微型條形碼變異位點占所有位點比為27.62%～39.05%，簡約信息位點占比為26.67%～39.05%。除微型條形碼105-2和105-4外，其他微型條形碼序列的變異情況與完整條形碼相差不大。HEBERT等［21］通過COXI條形碼序列對鳥類進行鑒定，結合其他動物類群的相關研究，提出“10×”的閾值規則，即種間平均遺傳距離大于種內平均遺傳距離的10倍的標準用于區分物種。本研究中的10個條形碼的平均種間距離是種內遺傳距離的18～40倍，說明每個條形碼都具有鑒定鯧屬魚類的潛力。

表9 鯧屬魚類完整條形碼與微型條形碼比較Tab.9 A comparison of full-length barcode and mini-barcodes of Pampus fishes

當物種間的種間最小遺傳距離大于種內最大遺傳距離，即可判定該物種存在條形碼間隙（barcode gap）。條形碼間隙是否存在決定了該條形碼能否有效鑒別物種。研究通過MEGA軟件，采用K-2-P模型計算了6個鯧屬魚類的種內遺傳距離及它們與其他所有個體兩兩間的遺傳距離。圖2中直線表示1∶1比例線，當數據點高于比例線時，說明種間最小遺傳距離大于種內最大遺傳距離，即存在條形碼間隙；反之，說明此條形碼不能用于區分該物種與其他物種。

由圖2得知，所有條形碼的數據點均在1∶1比例線之上，存在條形碼間隙，說明所有微型條形碼均可以有效區分不同的物種。優質的條形碼還應使各物種的種內遺傳距離盡可能小，并使物種間的遺傳距離盡可能大，以保證鑒定結果的可信度。比較得知，長度為211 bp的微型條形碼中，211-2區分效果最佳；長度為105 bp的微型條形碼中，105-3最佳。

圖2 鯧屬魚類ND2序列條形碼間隙Fig.2 Barcode gaps of ND2 sequences in Pampus fishes

2.5 系統發育分析

線粒體全基因組的系統發育分析結果見圖3，由圖3可見，本實驗所測得的序列中，銀鯧與NCBI網站的鐮鯧聚為一組，灰鯧與翎鯧聚為一組；在全部鯧屬魚類線粒體基因序列中，灰鯧的兩條基因組序列一條與翎鯧分為一組，一條與銀鯧聚為一組，剩余鯧屬魚類形成了較為可信的分支。

圖3 基于線粒體全基因組采用ML法構建的鯧屬系統進化樹Fig.3 Phylogenetic relationship tree of Pampus fishes built based on whole mitochondrial genome sequences by using maximum likelihood method

DNA條形碼建樹結果如圖4，完整條形碼以刺鯧為外群進行建樹分析。由圖4可知，鯧屬魚類DNA條形碼的聚類結果與全基因組聚類分化結果大致相同，不同點在于全基因組發育樹中珍鯧與鐮鯧聚為一支，而在完整條形碼發育樹中，鐮鯧最先分化出來。

圖4 基于ND2條形碼采用ML法構建的鯧屬系統進化樹Fig.4 Phylogenetic relationship tree of Pampus fishes built based on ND2 DNA barcode sequences by using maximum likelihood method

3 討論

鯧屬魚類線粒體基因組結構與硬骨魚類線粒體基因組結構相似，通常情況下，包含13個PCGs、2個rRNA基因、22個tRNA基因和一個Dloop區。本實驗所測得的銀鯧線粒體基因組出現了一個重復的tRNAMet結構，而NCBI網站的基因數據庫中鐮鯧（KF373560）的線粒體基因組同樣包含一個tRNAMet結構，CUI等［35］在Pampussp.的線粒體基因組中也發現了相同的結構，結合系統發育樹的聚類結果，這3條序列可能屬于同一物種。另外，珍鯧在16S rRNA-tRNAIle區域發生了ND1的重排，而且出現了額外的tRNAPro和Dloop區，其他鯧屬魚類線粒體基因組中沒有這種現象，并且NCBI網站的基因數據庫中珍鯧（MH037007）的基因組也沒有這種結構，產生這種情況的原因還需進一步研究。

3.1 銀鯧與鐮鯧的關系

銀鯧在1788年首次被EUPHRSSEN提出并進行了描述［36］，由于僅有一尾樣品，導致很多特征描述的并不詳實，很難進行準確的物種鑒別。近年來，有許多研究從形態特征對銀鯧進行了分類描述，可以將其與其他鯧屬魚類區分開來，然而根據這些特征無法將其與鐮鯧區分開來，李淵［15］認為前人所研究的銀鯧實際為鐮鯧，而真正的銀鯧分布于臺灣海峽以南；DIVYA等［37］認為銀鯧與鐮鯧在分子鑒定中沒有達到種間標準，屬于同一物種；YIN等［12］通過COXI基因標記研究也認為分布于中國東海的銀鯧與鐮鯧為同一物種。在本研究的結果中，所測銀鯧序列與已有的鐮鯧序列具有相同的重復結構，兩條序列在系統發育樹中聚為一支，且采集地點均為東海，而其他銀鯧的序列聚為另一支，采集地點為南海，這說明李淵［15］與YIN等［12］的觀點可能是正確的。即分布于東海的銀鯧與鐮鯧為同一物種，真正的銀鯧分布于臺灣海峽以南。

3.2 灰鯧與翎鯧的關系

1795年，BLOCH首次對灰鯧進行描述，但沒有進行詳細的分類特征描述，對灰鯧標本的采樣地點也并未記錄，因此對原始標本的具體描述并不能詳盡的給出［38］。翎鯧于1845年首次被TEMMINCK和SCHLEGEL描述，采集于日本長崎，但是所有描述是基于2尾鰭有損壞的樣本，且僅對鰭式、鱗片、吻部特征和頭部橫枕管等進行簡單描述，遺漏了很多重要的特征如鰓耙、脊椎骨數等，之后一直被學者認為是銀鯧的同物異名［15］。1998年，LIU和LI［10］將翎鯧列為鯧屬魚類的一種。而在本實驗中，所測得的灰鯧與翎鯧的線粒體基因組序列十分相似，DNA條形碼結果表示其種間距離基本為0，可判斷屬于同一物種。根據系統發育樹分析結果，兩條灰鯧基因組序列一條與翎鯧聚為一支，一條與銀鯧聚為一支，沒有形成獨立的分支，因此灰鯧的物種有效性有待商榷，其可能與翎鯧為同一物種，還需結合形態

特征進行綜合分析判斷。

3.3 鯧屬的物種數及鑒定方法

鯧屬的種類劃分問題，國內外眾多學者說法不一，且經歷了多個時期［4］，目前，在世界魚類數據庫（FishBase）中有5種鯧屬魚類［39］：銀鯧、中國鯧、鐮鯧、翎鯧和珍鯧。但是在魚類目錄中有8種鯧魚［40］，除上述5種外，新增了燕尾鯧、劉氏鯧和灰鯧。燕尾鯧在一些研究中被認為是灰鯧的同物異名［41］，但JAWAD和JIG［1］根據對軸向骨7個骨骼特征的研究，認為燕尾鯧是一個獨立的物種。劉氏鯧作為一新種，其研究較少，JAWAD和JIG［1］認為其為有效種，而YIN等［12］通過對其線粒體及核基因的研究，認為其為無效種，因此還需進一步的研究。本實驗的結果表明，灰鯧可能為翎鯧的同物異名。因此，目前鯧屬魚類可確定的物種僅有5種，即銀鯧、中國鯧、鐮鯧、翎鯧和珍鯧，而其余鯧魚的有效性存在爭議。鯧屬魚類的鑒定由于其形態上的相似性，導致根據外觀很難鑒別，因此較為準確的方法是通過比較基因序列進行鑒定，CUI等［14］通過對鯧屬魚類的16S rRNA和COXI基因標記進行擴增分析，結合GenBank同源序列，對鯧屬魚類進行了系統發育樹分析，將鯧屬魚類分為了5個物種：中國鯧、灰鯧、珍鯧、翎鯧和Pampussp.。李淵［15］通過對6種鯧屬魚類DNA條形碼進行擴增，提出了標準的DNA條形碼，并對GenBank中的相關序列進行糾正。本研究以ND2基因標記作為DNA條形碼對鯧屬魚類進行了分子鑒別分析，結果表明，無論是完整的條形碼還是微型條形碼，均可以將不同種的鯧屬魚類分辨開來。

然而，DNA條形碼鑒定中閾值法的判定規則存在爭議，閾值法是在物種間能夠形成DNA條形碼間隙的前提下，設定一個經驗遺傳距離作為閾值，當個體間遺傳距離大于閾值時，可以鑒定為不同物種［42］。閾值法在DNA條形碼物種鑒定中發揮著重要作用。然而，隨著DNA條形碼的深入研究，發現不同物種及不同DNA條形碼區段的閾值難以統一定量［43］。因此CUI等［35］認為可通過線粒體序列中的重復片段來鑒別不同的鯧魚，本研究中，所測東海區銀鯧序列中存在重復tRNAMet結構，珍鯧存在重復D-loop結構，且在5種鯧屬魚類的控制區序列中，除珍鯧外均有重復串聯序列，這些序列特征可為鯧屬魚類的鑒別提供參考。

另外研究發現，NCBI網站基因數據庫中一些序列存在錯配情況，例如序列號為FJ434351的翎鯧序列，其存在與本研究中東海區銀鯧和鐮鯧相同的重復tRNAMet結構，而其他翎鯧序列無此結構，所以此序列明顯為鐮鯧或東海區銀鯧。其余序列也出現了類似的情況，因此本研究對一些序列進行了校正。

3.4 鯧屬的系統發育分析

關于鯧屬魚類的系統發育分析，已有許多學者對其進行了研究，且結果不盡相同。劉靜等［44］根據分支系統學原理和方法，利用形態特征以刺鯧為外群對中國沿海鯧屬魚類的系統發育進行了分析，認為珍鯧是最原始、最早分化出來的種；銀鯧也是較原始、分化較早的種；中國鯧是較特化的種；翎鯧和灰鯧是一對姐妹種。李淵［15］通過分子學研究發現，鯧屬魚類的進化屬于單系發生類群，珍鯧和鐮鯧屬于較為原始的種類，而剩余的4種鯧屬親緣關系較近，應屬于晚分化的物種，翎鯧與中國鯧聚為一支，銀鯧和灰鯧處于系統進化樹的頂端，代表著最新演化的種類。YIN等［12］和CUI等［14］的系統發育樹結果一致，即分布于中國東海和黃海的銀鯧或鐮鯧為同一物種，與珍鯧聚為一支，為最先分化出的物種；翎鯧先與中國鯧聚為一支，之后再與灰鯧聚為一支，然后所有鯧屬魚類聚為一支。本研究結果顯示，中國東海的銀鯧與鐮鯧為同一物種，與珍鯧聚為一支，為首先分化出的物種；翎鯧與中國鯧聚為一支，之后再與南海的銀鯧聚為一支。分子進化結果與形態進化結果之間不是完全吻合的，這可能是由各種類間生活習性的趨同進化所引起的。

綜上可知，中國東海區的銀鯧或鐮鯧與珍鯧是鯧屬魚類中最先分化的物種，翎鯧和中國鯧為姐妹種，爭議點在于灰鯧是否為有效種以及南海區銀鯧的的系統發育地位，還需進一步的研究。

致謝：張衡博士參與部分樣本采集，孫丹丹碩士參與部分實驗，謹致謝忱。