南極大磷蝦共附生細(xì)菌多樣性及其防御功能研究

楊珍珠，趙 明，遲 海，何建國(guó)，郭長(zhǎng)軍，何 建，馬凌波，

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093；3.中山大學(xué)，廣東省海洋資源與近岸工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 440105）

南極大磷蝦（Euphausiasuperba）是鯨、魚(yú)、海豹等南大洋脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物的主要食物來(lái)源，在南大洋生態(tài)系統(tǒng)和食物鏈中處于核心地位，是地球上生物量最大、繁衍最成功的關(guān)鍵物種［1-2］。南極大磷蝦生活環(huán)境獨(dú)特，其體表、消化道等器官中定植了大量的共附生微生物［3］，這些共附生微生物可能與其宿主代謝、免疫、環(huán)境適應(yīng)、防御等重要生命活動(dòng)密切相關(guān)［4-6］，這也使得南極極端海洋微生物成為一個(gè)天然資源庫(kù)而被關(guān)注。然而目前對(duì)南極大磷蝦的研究還主要集中在捕撈、貯藏和產(chǎn)品加工等［7-8］，對(duì)于南極大磷蝦共附生細(xì)菌的物種多樣性以及其可能的生物學(xué)功能少見(jiàn)報(bào)道。因此，分析南極大磷蝦中微生物的菌群結(jié)構(gòu)和物種多樣性，掌握微生物的適應(yīng)、防御功能作用，能為發(fā)掘南極大磷蝦微生物資源提供新思路。

群落結(jié)構(gòu)是指一個(gè)生物環(huán)境內(nèi)相互之間具有直接或間接關(guān)系的所有生物組成狀況，群落結(jié)構(gòu)決定生態(tài)功能的特性，生態(tài)環(huán)境的變化會(huì)間接引起群落結(jié)構(gòu)的變化，通過(guò)分析目標(biāo)環(huán)境微生物群落的菌群結(jié)構(gòu)，能夠?yàn)榘l(fā)現(xiàn)新的重要微生物功能類(lèi)群提供可靠依據(jù)［9］。趙文靜等［10］采用宏基因組測(cè)序技術(shù)分析南極魚(yú)皮膚微生物的多樣性，初步了解南極魚(yú)皮膚微生物的種類(lèi)及菌群結(jié)構(gòu)；張麗珉等［11］利用16SrRNA技術(shù)研究了南極羅斯海區(qū)域可培養(yǎng)土壤微生物的多樣性，為開(kāi)發(fā)利用南極微生物資源奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)宏基因組技術(shù)分析南極海域特殊條件下的細(xì)菌組成特征，可以進(jìn)一步體現(xiàn)細(xì)菌群落完整性，實(shí)現(xiàn)對(duì)特殊條件下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和基因功能的分析［12］。

本研究以南極大磷蝦為原材料，采用宏基因組測(cè)序技術(shù)分析南極大磷蝦不同組織中的微生物多樣性，并通過(guò)細(xì)菌純培養(yǎng)技術(shù)獲得可培養(yǎng)菌株，對(duì)其進(jìn)行抑菌活性以及氟化鈉耐受性分析，研究南極大磷蝦中細(xì)菌的防御功能，從而探索南極大磷蝦與其相關(guān)功能微生物的相互作用關(guān)系，以期為發(fā)掘特殊環(huán)境微生物新物種和南極大磷蝦資源綜合利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與菌株

南極大磷蝦由南極考察隊(duì)提供，平均體長(zhǎng)25～35 mm，平均體質(zhì)量0.8～2.5 g，捕撈后以50 cm×10 cm×5 cm的規(guī)格進(jìn)行船上凍結(jié)，運(yùn)輸后于-80℃條件下實(shí)驗(yàn)室備用。

單增李斯特菌LFM2813（Listeria monocytogenesLFM2813）、金黃色葡萄球菌LFM3263（StaphylococcusaureusLFM3263）、蠟樣芽孢桿菌LFM2805（BacilluscereusLFM2805）、大腸埃希氏菌LFM3704（EscherichiacoliLFM3704）、副溶血性弧菌ATCC17802（VibrioparahemolyticusATCC17802）由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所保存。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基和試劑如下：Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基；2216E培養(yǎng)基（青島科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion，BHI）（美國(guó)BD公司）；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）（北京索萊寶公司）；細(xì)菌基因組提取試劑盒Taq酶（日本Takara公司）；營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基、氯化鈉、甘油（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氟化鈉（NaF）［生工（上海）生物工程股份有限公司］。

1.3 主要儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所需主要儀器與設(shè)備如下：YXQ-LS-50SII立式滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠）；HH.B11.500-BS-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠）；超凈工作臺(tái)SEX-TJ（上海整新電子設(shè)備）；TG16WS高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；普通PCR儀（美國(guó)Thermo公司）；XY300C電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）；Miseq高通量測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 宏基因組測(cè)序

任意選取15～30只、總重25 g的南極大磷蝦，解凍后無(wú)菌條件下解剖獲得眼柄（Et）、胃（St）、尾部（Ti）及腸道（Mi）組織。液氮速凍后置于-80℃保存至DNA提取。DNA提取使用DNeasy PowerSoil Kit（100）（QIAGEN，Hilden，Germany），提取方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。使用細(xì)菌16S rDNA的V3V4通用引物343F（5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′）和798R（5′-AGGGTATCTAATCCT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用磁珠純化后作為模板進(jìn)行二次擴(kuò)增，隨后再使用磁珠純化，純化產(chǎn)物使用Qubit進(jìn)行定量，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣后使用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4.2 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序原始數(shù)據(jù)使用Trimmomatic軟件進(jìn)行去接頭和質(zhì)量過(guò)濾，去除長(zhǎng)度小于50 bp的序列，使用Flash軟件進(jìn)行連接處理和拼接得到拼接序列，采用split_libraries軟件進(jìn)一步質(zhì)控，去除拼接序列中含有N堿基、單堿基重復(fù)大于8以及長(zhǎng)度小于200 bp的序列得到合格序列，采用UCHIME軟件去除合格序列中的嵌合體得到優(yōu)質(zhì)序列。所得序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋確定物種信息并統(tǒng)計(jì)相應(yīng)豐度。使用單因素方差分析（ANOVA）對(duì)樣本不同分組的豐富度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

細(xì)菌相對(duì)豐度表示在細(xì)菌群落中某一菌群的豐度與所有菌群豐度之和的比值，用以反映某種菌群在整個(gè)細(xì)菌群落中所占的比例。

1.4.3 菌株培養(yǎng)

無(wú)菌操作稱(chēng)取25 g解剖獲得的南極大磷蝦組織樣品（眼柄、胃、尾部、腸道），加入225 mL無(wú)菌生理鹽水，靜置30 min后進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?00 μL的樣品分別涂布于LB、2216E、TSB、NB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后將生長(zhǎng)于培養(yǎng)基中的單菌落接種在LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h后在13%（v／v）甘油中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 抑菌活性及穩(wěn)定性的鑒定

以單增李斯特菌LFM2813、金黃色葡萄球菌LFM3263、蠟樣芽孢桿菌LFM2805、大腸埃希氏菌LFM3704、副溶血性弧菌ATCC17802為指示菌株，以從南極大磷蝦中分離的細(xì)菌為指標(biāo)菌，參考遲海等［13］方法，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法篩選出具有抑菌活性的菌株并測(cè)其經(jīng)過(guò)高溫和酶處理后的抑菌情況。

1.4.5 細(xì)菌基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增及菌種鑒定

細(xì)菌基因組DNA的提取按照試劑盒提供的方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增以目標(biāo)細(xì)菌的基因組DNA為模板，使用Taq酶與上游引物12F：5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′和下游引物15R：5′-TACGGGAGGCAGCCAG-3′建立50μL擴(kuò)增體系。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，進(jìn)入PCR循環(huán)階段后，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。取20μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測(cè)序。

1.4.6 對(duì)NaF耐受能力鑒定

參考CUI等［14］方法測(cè)定從南極大磷蝦中篩選的指標(biāo)菌對(duì)NaF的耐受能力。將指標(biāo)菌分別接種于含有0.5%、1%、2%、3%和5%NaF的LB固體培養(yǎng)基中，以接種在不添加NaF的LB培養(yǎng)基上的指標(biāo)菌為空白對(duì)照，30℃培養(yǎng)48 h后，觀察指標(biāo)菌的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組測(cè)序

本實(shí)驗(yàn)分別將南極大磷蝦4個(gè)組織部位進(jìn)行組內(nèi)劃分，每個(gè)組織再分成5組，共獲取20個(gè)不同南極大磷蝦組織樣本。宏基因組測(cè)序結(jié)果經(jīng)質(zhì)控之后的合格序列數(shù)據(jù)量分布在88 682～95 870之間，經(jīng)過(guò)去除嵌合體得到的優(yōu)質(zhì)序列數(shù)據(jù)量分布在65 536～84 145之間，優(yōu)質(zhì)序列的平均長(zhǎng)度分布在411.31～415.88 bp，各樣本可操作分類(lèi)單元（OTU）個(gè)數(shù)分布在4 274～6 816之間。此外，南極大磷蝦組織樣本通過(guò)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)OTU有顯著性差異的個(gè)數(shù)為3 617個(gè)，在屬水平上有顯著性差異的個(gè)數(shù)為293個(gè)，在門(mén)水平上有顯著性差異的個(gè)數(shù)為18個(gè)。

2.2 南極大磷蝦共附生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布

圖1是南極大磷蝦不同組織部位的微生物群落在門(mén)水平上的相對(duì)豐度，結(jié)果表明，細(xì)菌群落相對(duì)豐度較大的主要有4大類(lèi)：變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）。其中，在南極大磷蝦眼柄、尾部和腸道中，變形菌門(mén)的群落相對(duì)豐度最高，分別占各組織細(xì)菌總量的41.4%、35.8%、59.5%，而在南極大磷蝦胃部，厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度最高，占細(xì)菌總量的32.2%。

圖1 門(mén)水平上南極大磷蝦中不同部位微生物菌群的相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundance of bacteria in the level of door from different parts of E.superba

熱圖可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過(guò)顏色的變化與相似程度反映不同樣品在分類(lèi)水平上群落組成的相似性和差異性［15］，顏色越紅表示菌門(mén)在樣本中的相對(duì)豐度越高，顏色越藍(lán)表示菌門(mén)在樣本中的相對(duì)豐度越低。由圖2可見(jiàn)，南極大磷蝦腸道組織含有較大的紅色區(qū)域，說(shuō)明腸道中含有較多的高豐度細(xì)菌，而南極大磷蝦胃部含有較大的藍(lán)色區(qū)域，說(shuō)明胃部組織含有較多低豐度細(xì)菌，從整體上看，南極大磷蝦腸道和胃部細(xì)菌群落的豐度差異較大。

圖2 門(mén)水平上南極大磷蝦中不同部位微生物的物種豐度熱圖Fig.2 Relative abundance heatmap of bacteria in the level of door from different parts of E.superba

2.3 南極大磷蝦微生物多樣性分析

表1為南極大磷蝦不同部位所得到的微生物物種數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)信息。Chao指數(shù)反映整個(gè)群落的豐富度（不考慮群落中每個(gè)物種的豐度），Shannon指數(shù)反映樣品的均一性［16］。結(jié)果表明，南極大磷蝦眼柄和尾部微生物物種多樣性較高，觀察到的物種數(shù)分別為6 842.1和6 938.7，南極大磷蝦胃部和腸道物種多樣性較低，觀察到的物種數(shù)分別為5 099.0和5 229.2。南極大磷蝦眼柄和尾部的Chao指數(shù)明顯高于胃部和腸道，說(shuō)明南極大磷蝦眼柄和尾部群落豐度明顯高于胃部和腸道。南極大磷蝦尾部的Shannon指數(shù)最高，說(shuō)明尾部的微生物菌群均一性最好。

表1 南極大磷蝦不同部位微生物的多樣性指數(shù)Tab.1 Diversity index of bacteria from different parts of E.superba

圖3和圖4為南極大磷蝦不同部位不同分組的微生物二維和三維的PCA分析，結(jié)果表明，南極大磷蝦腸道和胃部的同一組樣品距離較近，分組效果較好，而眼柄和尾部同一組樣品較分散，分組效果較差。南極大磷蝦胃部和腸道整體分布相差較遠(yuǎn)，因此腸道和胃部的微生物組成差異較大，這與前述物種豐度熱圖分析結(jié)果相一致。南極大磷蝦腸道和眼柄樣品分布較近，說(shuō)明南極大磷蝦腸道和眼柄微生物組成較相似。

圖3 南極大磷蝦不同部位微生物的PCA（2D）分析Fig.3 PCA（2D）analysis of bacteria from different parts of E.superba

圖4 南極磷蝦不同部位微生物的PCA（3D）分析Fig.4 PCA（3D）analysis of bacteria from different parts of E.superba

2.4 有抑菌活性細(xì)菌的篩選、鑒定及抑菌穩(wěn)定性測(cè)定

通過(guò)直接培養(yǎng)南極大磷蝦組織，從4種培養(yǎng)基中共獲得60株細(xì)菌，將全部細(xì)菌作為指標(biāo)菌，篩選可以抑制革蘭氏陽(yáng)性菌［單增李斯特菌（Lis.monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）］和革蘭氏陰性菌［大腸埃希 氏 菌（E.coli）、副 溶 血 性 弧 菌（V.parahemolyticus）］的菌株。其中只有一株細(xì)菌對(duì)上述革蘭氏陽(yáng)性菌有明顯的抑菌作用，經(jīng)16S rDNA測(cè)序和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，該細(xì)菌鑒定為馬胃葡萄球菌（S.equorum）。

微生物可以產(chǎn)生許多種抑菌物質(zhì)，如抗生素、過(guò)氧化氫、酸和細(xì)菌素等。實(shí)驗(yàn)室篩選的馬胃葡萄球菌所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)具有熱穩(wěn)定性強(qiáng)和易被蛋白酶分解的特點(diǎn)，在經(jīng)過(guò)熱處理后對(duì)單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌仍具有抑菌活性，而在經(jīng)過(guò)蛋白酶處理后對(duì)上述細(xì)菌全部失活（表2）。這一結(jié)果說(shuō)明，馬胃葡萄球菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有細(xì)菌素的基本特征。

表2 不同處理后馬胃葡萄球菌抑菌產(chǎn)物的抑菌穩(wěn)定性Tab.2 Antibacterial stability of antibacterial substance produced by S.equorum under different treatments

2.5 對(duì)NaF耐受能力的測(cè)定

為了驗(yàn)證南極大磷蝦細(xì)菌對(duì)NaF耐受能力，將所篩選的60株細(xì)菌均培養(yǎng)于含有不同NaF的LB培養(yǎng)基上，結(jié)果顯示，17株細(xì)菌可以在含有0.5%NaF的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，6株細(xì)菌可以在含有1%NaF的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，高于1%含量NaF的培養(yǎng)基（2%～5%）均未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。將具有耐受NaF細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定，在1%NaF培養(yǎng)基耐受下生長(zhǎng)的細(xì)菌與0.5%NaF條件下耐受細(xì)菌一致，高濃度NaF條件下的細(xì)菌為嗜冷桿菌屬（Psychrobacterspp.）、鞘 脂 菌 屬（Sphingobiumspp.）、微小桿菌屬（Exiguobacteriumspp.）和馬賽菌屬（Massiliaspp.）。

3 討論

南極大磷蝦是南極海域生物量最大的物種之一，對(duì)維持海域生態(tài)平衡和保持食物鏈完整起到重要作用［17］。同時(shí)，南極大磷蝦共附生微生物也是潛在的可利用資源之一。然而南極海域生態(tài)環(huán)境特殊，大部分細(xì)菌具有高壓、低溫和寡營(yíng)養(yǎng)的生長(zhǎng)特點(diǎn)［18］，這也為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)純培養(yǎng)和微生物物種多樣性分析增加了難度。本研究利用宏基因組測(cè)序技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不可培養(yǎng)及低豐度細(xì)菌的分析，完整地體現(xiàn)了南極大磷蝦共附生細(xì)菌的特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在南極大磷蝦的眼柄、尾部中，群落相對(duì)豐度最高的均為變形菌門(mén)，這可能是南極大磷蝦體表定植了大量適應(yīng)外界環(huán)境的變形菌門(mén)的嗜冷菌屬細(xì)菌，遲海等［19］報(bào)道的不同貯藏溫度下南極大磷蝦體內(nèi)多為嗜冷微生物的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。南極大磷蝦腸道中相對(duì)豐度最高的為變形菌門(mén)，但是南極大磷蝦胃部相對(duì)豐度最高的是厚壁菌門(mén)，且通過(guò)多樣性分析發(fā)現(xiàn)南極大磷蝦腸道組織和胃部組織微生物組成差異較大，說(shuō)明消化道不同部位的菌群結(jié)構(gòu)也有顯著差異，這可能是由于大部分厚壁菌門(mén)可以適應(yīng)酸性等極端環(huán)境，并適合在胃部環(huán)境中生長(zhǎng)。

南極大磷蝦生活海域海水的含氟量約為1.25 mg·kg-1，而南極大磷蝦整蝦中氟含量極高，其值在1 142～2 400 mg·kg-1，甲殼氟含量約為4 000～8 000 mg·kg-1，肌肉氟含量約為250 mg·kg-1［20-22］。氟含量過(guò)高通常會(huì)對(duì)生物體造成危害，而南極大磷蝦仍能正常生長(zhǎng)，這可能是由于南極大磷蝦在脫殼過(guò)程中需要氟的作用。潘建明等［23］在研究氟在南極大磷蝦生長(zhǎng)中的遷移變化規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，南極大磷蝦的蝦殼具有富集氟的作用，在脫殼過(guò)程中氟會(huì)通過(guò)某種方式回歸到海洋環(huán)境中，蝦肉中的氟可能在即將脫殼時(shí)短時(shí)間轉(zhuǎn)移至新生蝦殼中，因此活的南極大磷蝦肌肉中氟含量很低。此外，南極大磷蝦共附生微生物也可能對(duì)其體內(nèi)高含量的氟起到一定的防御作用。本實(shí)驗(yàn)中，從南極大磷蝦分離的細(xì)菌可在0.5%～1%（相當(dāng)于5 000～10 000 mg·kg-1）的NaF下耐受生長(zhǎng)，這說(shuō)明南極大磷蝦共附生微生物可能在氟的刺激下合成了次生拮抗物等化學(xué)防御物質(zhì)，建立了機(jī)體防御屏障，從而維持宿主健康，這與CUI等［14］對(duì)南極大磷蝦功能微生物的研究結(jié)果一致。

南極大磷蝦共附生微生物還能產(chǎn)生有抑菌活性的物質(zhì)，這些抑菌物質(zhì)能抑制或殺滅致病菌，并防止其在宿主體內(nèi)定植，從而達(dá)到維持宿主機(jī)體健康的目的。本研究分離得到的一株產(chǎn)細(xì)菌素的馬胃葡萄球菌，具有廣譜抑菌特性，且抑菌產(chǎn)物耐高溫，具有易被蛋白酶水解的細(xì)菌素特性。目前，對(duì)于馬胃葡萄球菌細(xì)菌素的研究只局限于對(duì)單增李斯特菌的抑菌應(yīng)用，對(duì)其特性研究尚未深入［24］。此外，關(guān)于南極大磷蝦中可產(chǎn)細(xì)菌素的共附生微生物的研究也還未見(jiàn)報(bào)道。本研究中馬胃葡萄球菌屬于南極大磷蝦胃部的優(yōu)勢(shì)菌群，這說(shuō)明南極生物中胃腸道共附生微生物可作為新型活性物質(zhì)的資源之一，該結(jié)果可為南極大磷蝦的進(jìn)一步加工利用提供新的方向。