饑餓對眼斑雙鋸魚幼魚形態特征的影響

王海山，葉 樂，陳 治，楊超杰，胡清雨

（1.海南熱帶海洋學院水產與生命學院，海南三亞 572022；2.教育部熱帶海洋生物資源利用與保護重點實驗室，海南三亞 572022）

魚類的形態是其重要的特征，在魚類育種工作中通常將某些形態指標作為重要的選育指標［1］，因此，采集魚類形態特征信息是魚類生態調查和育種的重要基礎工作。圖像分析系統的發展促進了形態測量法的發展和多樣化，并擴大了使用形態測量法作為種群識別工具的潛力；使用多元技術，如主成分和判別分析來量化形態變量，在種群識別方面也受到越來越多的關注［2］。研究表明，由于生境［3-4］、性別［5-6］、生長發育階段［7-9］等方面的不同，魚類形態信息存在著種內差異。在自然生境中，魚類常受到饑餓的脅迫，饑餓會影響魚類生長、生理、代謝、行為等方面，這些研究目前已經較多見［10-12］，而饑餓對魚類形態特征影響方面的研究相對匱乏［13］。

眼斑雙鋸魚（Amphiprionocellaris）俗稱公子小丑，屬?？~亞科（Amphiprioninae），是重要的海水觀賞魚種類之一。小丑魚人工繁殖已經可以大規模實施，但許多研究工作尚未開展。目前國內對于眼斑雙鋸魚的報道僅見胚胎發育［14-15］、營養［16-17］和藥物應激生理［18］等方面，國外則多聚焦于性轉化［19］、領域行為［20］和熱應激［21］等問題，而饑餓對眼斑雙鋸魚形態性狀影響還未見報道。在生態調查和人工養殖中，魚類的營養狀況調查非常重要。特別在人工養殖過程中，由于投餌不足或餌料適口性和營養未能滿足魚類需求會使魚類處于長期饑餓狀態，容易引發疾病，導致魚類大量死亡。通過魚類饑餓狀態判別可以推斷前一段時間投喂量是否適當，飼料營養是否合理，有助于改進養殖措施。但目前對魚類饑餓營養狀態判斷往往僅憑個人經驗，沒有在生產上適用的量化指標。因此，本研究通過圖像分析軟件采集數據，運用t檢驗、聚類分析、因子分析和判別分析，研究饑餓對眼斑雙鋸魚幼魚形態性狀變異的影響，旨在揭示饑餓和非饑餓條件下眼斑雙鋸魚主要形態性狀的差異，通過量化指標評估其饑餓狀態，為眼斑雙鋸魚的生態調查和人工養殖提供參考資料、奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與處理方法

實驗于2019年12月在海南熱帶海洋學院實驗室進行。實驗魚購自海南萬寧小丑魚繁殖場，選取同一批親魚產卵孵化培育60 d的健康幼魚180尾，打包充氧帶回實驗室，在實驗室循環水系統中暫養，7 d后隨機分到60 cm×40 cm×40 cm玻璃養殖缸中。實驗設饑餓組和對照組，每組30尾，設3個平行。對照組正常投喂（與暫養時一致），每日投喂2次配合飼料（佛山市順德區全興水產飼料有限公司生產的頂旺牌石斑魚配合飼料0＃料），日按體質量1%～2%投喂，根據攝食情況調節，饑餓組不投喂，其余養殖條件一致。暫養和實驗均為循環水養殖，每天采用7 w LED燈光照12 h，水溫25～26℃。實驗進行7 d，實驗結束后全部取樣，然后用MS-222麻醉劑將魚麻醉后進行拍照和體質量測定。

1.2 數據測量和分析方法

用吸水紙吸干魚體表水分后用精度為0.001 g的電子天平測量體質量（W，g），然后在體視顯微鏡下對每條魚進行正反面拍照，用Image-Pro plus 6.0軟件準確測量每條幼魚的形態性狀，包括全長（TL）、體長（SL）、體高（BD）、頭長（HL）、頭高（HD）、吻長（SnL）、尾柄長（CL）、尾柄高（CD）、背鰭前距（PDL）、胸鰭前距（PPL）、腹鰭前距（PVL）、臀鰭前距（PAL）、眼徑（ED）、瞳孔直徑（PD）等14個指標，精確至0.001 mm。

測量的形態性狀指標如圖1所示，為減少操作誤差，所有樣品魚的測量指標由2人分別測定，每人對魚體左右側所有指標各測定1次，綜合兩人測定的4組數據取平均值作為最終數值用于統計。

圖1 形態指標測量示意圖Fig.1 Schematic diagram of morphological index measurement

計算各性狀的平均值和標準差，進行獨立樣本t檢驗。各性狀變異系數（CV）的估計公式：CV=（標準差／平均值）×100%；肥滿度（K）計算公式：K=（W／L3）×100%。

為消除魚體大小差異的影響，將可量性狀參數轉化為比值參數，取全長／體長（TL／SL）、體長／體高（SL／BD）、體長／頭長（SL／HL）、體高／頭高（BD／HD）、頭長／吻長（HL／SnL）、體長／尾柄長（SL／CL）、尾柄長／尾柄高（CL／CD）、體長／背鰭前距（SL／PDL）、體長／胸鰭前距（SL／PPL）、體長／腹鰭前距（SL／PVL）、體長／臀鰭前距（SL／PAL）、體高／尾柄高（BD／CD）、頭長／眼徑（HL／ED）、頭長／瞳孔（HL／PD）共14個形態比值參數。對未經處理的形態性狀、體質量、肥滿度和形態比值參數等數據進行獨立樣本t檢驗，當P＜0.05時，表示參數在兩組之間差異性顯著，當P＜0.01時，表示參數在兩組之間差異性極顯著。分別將所有試驗魚的14項形態性狀和14個比值數據，用IBM SPSSstatistics25進行聚類分析、因子分析和判別分析。聚類分析采用系統聚類法；因子分析采用主成分提取，最大四次方值法（quartimax method）進行旋轉；判別分析采用Wilks’Lambda步進法，獲得未標準化判別方程。

2 結果與分析

2.1 可量性數據和比值數據t檢驗

對眼斑雙鋸魚幼魚體質量和形態性狀數據t檢驗結果見表1。結果顯示，饑餓組和對照組除了尾柄高有顯著差異外（P＜0.05），其余形態性狀包括體質量和肥滿度均未達到顯著性差異水平（P＞0.05）。形態比值參數數據t檢驗結果見表1。結果顯示，TL／SL、SL／BD、SL／HL、BD／HD、HL／SnL和SL／CL等6個參數在饑餓組和對照組間無顯著性差異（P＞0.05）；CL／CD在兩組之間差異性顯著（P＜0.05）；SL／PDL、SL／PPL、SL／PVL、SL／PAL、BD／CD、HL／ED和HL／PD等7個參數在兩組之間差異性極顯著（P＜0.01）。

表1 表型性狀和形態比值數據的t檢驗結果Tab.1 t-test results of measurable traits and morphological ratio data between starvation and control group

2.2 聚類分析

分別對所有試驗魚的形態性狀數據和比值數據進行系統聚類分析表明，對2類數據進行的系統聚類分析可以將全部試驗魚分為2大類，分別包含饑餓組和對照組魚類。

2.3 因子分析

對直接測量獲得的形態性狀數據進行因子分析結果見表2，只獲得1個主成分。該主成分對變異的方差貢獻率較大（77.478%），包含了群體總變異的大部分。對主成分的因子負荷矩陣進一步分析，發現主成分1在全部形態性狀的載荷值均大于0.5，即主要反映整體形態的變化，不能具體分析主要差異在哪。強行提取3個主成分并運用主成分1、2和3成分得分系數繪制三維立體圖，結果如圖2-a所示。由圖2-a可見，饑餓組和對照組群體分布區域絕大部分重疊，不能分開。

表2 形態性狀數據的載荷矩陣及主成分對總變異的貢獻率Tab.2 Loading matrix of morphological data and contribution rate of principal components to total variation

對形態比值參數進行因子分析共獲得4個主成分，綜合指標分析結果見表3。4個主成分對變異的方差貢獻率較大，分別為25.625%、21.836%、16.005%和9.233%，累積貢獻率為72.689%，這4個主成分包含了群體總變異的大部分。對主成分的因子載荷矩陣進一步分析，發現主成分1在SL／HL、SL／PDL、SL／PPL和SL／PVL的載荷值均大于0.7，即主要反映頭長和各魚鰭相對位置的變化；主成分2在HL／PD上載荷值較大（載荷值＞0.9），主要反映魚頭部和瞳孔之間的形態變化；主成分3在CL／CD和BD／CD的載荷值較大（載荷值＞0.6），主要反映尾柄部位的形態變化；主成分4在BD／HD的載荷值較大（載荷值＞0.6），主要反映頭部高度的形態變化。從主成分1、2、3和4可見，2個實驗群體的魚在形態上的差別主要是由魚頭部形態、各魚鰭相對位置和尾柄部位差異引起。運用主成分1、2和3成分得分系數繪制三維立體圖，結果如圖2-b所示。由圖2-b可見，饑餓組和對照組群體只有極少量重疊區域，絕大部分可以分開。

圖2 利用形態性狀（A）和形態比值數據（B）進行因子分析的主成分三維圖Fig.2 Three dimensional principal component diagram of factor analysis for morphological data（A）and morphological ratio data（B）

表3 形態比值參數數據的載荷矩陣及主成分對總變異的貢獻率Tab.3 Loading matrix of morphological ratio parameter data and contribution rate of principal components to total variation

2.4 判別分析

對形態性狀數據進行經判別分析篩選得到貢獻最大的4個參數，分別為PDL、PPL、PVL和PAL，據此構建未標準化典則判別函數方程Y1=-3.010+2.144PDL-2.243PPL-1.068PVL+0.994PAL。饑餓組Y1平均值為-1.385，對照組Y1平均值為1.157；對形態比值數據進行經判別分析篩選得到貢獻最大的3個參數，分別為BD／HD、HL／ED、HL／PD，分別以X1、X2、X3表示，據此構建未標準化典則判別函數方程Y2=-8.224 5+0.265X1-1.852X2+2.174X3。饑餓組Y2平均值為-8.245，對照組Y2平均值為6.887。判斷某尾魚的群體是否為饑餓狀態時，將所測數據代入方程，獲得的函數值與哪組平均值更接近即為其所屬狀態。上述2個函數的威爾克Lambda顯著性P＜0.01，表明均有統計學意義。

為了驗證上述判別方程的實用性，對建立的判別方程進行預測分析和統計評價，判別結果見表4。結果可見，由形態性狀數據建立的方程，饑餓組中有8尾誤判到對照組中，判別正確率為90.00%，對照組中有7尾誤判到饑餓組中，判別正確率為91.25%；而使用形態比值數據建立的方程，饑餓組和對照組判別準確率均為100.00%，交互驗證結果證明使用形態比值數據建立的判別函數可信度高于使用形態性狀數據建立的方程。

表4 對照組和饑餓組試驗魚的判別驗證結果Tab.4 Discrimination results for judging A.ocellaris starving status

3 討論

3.1 魚類饑餓形態性狀變異

魚類形態性狀存在種間差異［22］，也存在種內差異。已有研究表明，引起種內形態差異的原因有不同地理居群的形態分化［23］、性別［5］、不同生長發育階段［8-9］和環境因素［3-4，24-25］。自然環境中的餌料缺乏以及養殖過程中餌料投喂不當等常導致魚類處于饑餓的脅迫狀態，研究發現，饑餓對魚類形態特征存在顯著影響，如中華倒刺鲃（Spinibarbussinensis）仔魚隨著饑餓程度增加，體長和體高均顯著下降［26］；饑餓時牙鲆（Paralichthysolivaceus）前后體軸相關的形態性狀數值下降，頭部形態特征的經典尺寸（classical dimensions）顯著增大［27］；鯉（Cyprinuscarpio）幼魚饑餓后體高明顯下降，導致體高／體長明顯下降，體型變得更加“細長”［13］；本研究與之不同的是，本研究中7 d的饑餓脅迫并沒有對眼斑雙鋸魚幼魚形態和體質量指標產生顯著影響，這可能與種間差異和饑餓脅迫的時間還不足夠長有關，但大多數形態比值在饑餓組和對照組之間已出現顯著差異，因此本研究證實了饑餓脅迫確實對魚類的形態性狀特征造成了影響，形態參數可作為一個衡量魚類饑餓狀態的有效指標。

3.2 魚類形態測量分析技術

傳統魚類形態測量方法為盡可能的減少人為誤差，加大了取樣數量，增加了工作量，測定時魚類離水時間過長難免造成魚類死亡。因此本研究摒棄傳統游標卡尺現場測定的方法，采用較先進的圖像分析技術，用麻醉劑將魚麻醉后拍照，再用電腦軟件分析，精確度高，而且對于同一批實驗樣本，采用2人測定正反面數據取平均值再統計，進一步消除了人為誤差，使得結果更為可信。

因子分析是一種多元統計方法，已廣泛應用于各個領域的調查和分析，如：1）地理種群區分：楊琴等［23］運用主成分和判別分析發現，影響鳳鱭（Coiliamystus）群體形態差異的主要因素在軀干部和尾部，并且構建了4個群體的判別方程；KARTAVTSEV等［28］通過形態計量學性狀的因子分析和判別分析發現，太平洋鯡魚（Clupea pallasii）本地種群具有明顯生物學意義的3個分化群存在；2）魚類的行為和環境分析：QUEIROZ等［29］通過幾何形態測量方法發現，松鯛（Lobotes surinamensis）、圓眼燕魚（Plataxorbicularis）和疣鱗鲀（Canthidermismaculata）3種魚的幾何形態與其伴生植物的幾何形態具有較強的相關性；3）群落結構分析：BAGHERI等［30］運用主成分分析揭示了網箱養殖對浮游動物豐度的影響；4）性別判別：武兆文等［6］運用主成分分析發現，雌雄雜交黃顙魚的差異主要集中在肥滿度及外部輪廓指標上，并建立了性別判別函數。本研究采用因子分析和判別分析，嘗試對魚類的饑餓狀態進行評估。結果表明，與t檢驗方法相比，因子分析和判別分析可以更清晰地揭示變異的主要因素。t檢驗未發現7 d饑餓對體質量、肥滿度和大部分形態性狀參數造成顯著影響，而對8個形態性狀比參數（CL／CD、SL／PDL、SL／PPL、SL／PVL、SL／PAL、BD／CD、HL／ED和HL／PD）則均有顯著影響，導致無法判斷主要變異因子具體為哪些可度量參數。因此，進一步的因子分析通過提取主成分和旋轉矩陣，而獲得較清晰的形態變異因子，揭示其主要變異由魚頭部形態、各魚鰭相對位置和尾柄部位引起。而進一步經判別分析得出的饑餓狀態的未標準化典則判別方程，通過檢驗發現將所測相關數據代入方程即可有效快捷地評估魚類的饑餓狀態。除未標準化方程以外，還有標準化方程，而標準化方程需要將所測數據進行標準化處理再代入方程中才能計算。本研究選取的未標準化方程則可直接將測量數據代入方程中計算，不需標準化處理，相比標準化方程更加方便快捷。