固相萃取-液相色譜-質譜法檢測水產養(yǎng)殖水中的孔雀石綠及其代謝物、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素微量殘留

郭偉偉，孫志洪

(1. 滄州市生態(tài)環(huán)境監(jiān)控中心，河北 滄州 061000; 2. 河北省滄州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，河北 滄州 061000)

0 引 言

我國是全球水產養(yǎng)殖大國，水產養(yǎng)殖業(yè)是我國農業(yè)產品貿易的優(yōu)勢產業(yè)，現(xiàn)已成為我國農業(yè)產品貿易發(fā)展的穩(wěn)壓器。水產養(yǎng)殖業(yè)在我國發(fā)展歷史十分悠久，早在北宋時期我國就有開展水產養(yǎng)殖的記載，水產養(yǎng)殖主要有淡水養(yǎng)殖、海水養(yǎng)殖和循環(huán)水養(yǎng)殖3種，其中淡水養(yǎng)殖在我國南、北方地區(qū)均大量存在，淡水養(yǎng)殖水產品種主要有：鯽魚、鱸魚、蝦、蟹等品種，均是我國老百姓餐桌上的美食[1-3]。水產品在養(yǎng)殖的過程中，為提高單位養(yǎng)殖密度和減少病蟲害，養(yǎng)殖戶常在養(yǎng)殖過程中使用抗生素、殺菌劑等，近些年，隨著水產養(yǎng)殖業(yè)的集約化、規(guī)模化等的發(fā)展，水產養(yǎng)殖行業(yè)出現(xiàn)了一些被老百姓關注的問題，如抗生素超標、重金屬超標等現(xiàn)象時有發(fā)生[4-8]。孔雀石綠是一種三苯甲烷類工業(yè)染料，氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素等抗生素，因其價格便宜，且具有殺菌、消毒的作用，因此在水產養(yǎng)殖過程中常有使用。人們誤食用被該類藥物污染的水產品時，會導致體內抗生素殘留增加，尤其對嬰幼兒影響較大，輕者產生耐藥性，重者可能導致藥物中毒[9-12]。因此，加強對水產養(yǎng)殖水中的孔雀石綠及其代謝物、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素的監(jiān)測，可以有效保護水產養(yǎng)殖用水資源、合理指導水產養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。

現(xiàn)階段，許多學者針對地表水和水產品中孔雀石綠、氧氟沙星等進行了研究，如：王金秀、任蘭正等研究了離子液體萃取-分光光度法測定水樣中的孔雀石綠殘留的分析方法[13]，馮濤、鄔玲玲等研究了高效液相熒光法測定養(yǎng)殖水產中恩諾沙星等四種氟喹諾酮類藥物殘留[14]，關于水產養(yǎng)殖用水中孔雀石綠及其代謝物、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素微量殘留的研究不多，其中分光光度法和液相色譜法專屬性較差、且靈敏度偏低，不適用于水產養(yǎng)殖用水中極微量藥物殘留的監(jiān)測。實驗研究一種采用固相萃取提取、凈化水產養(yǎng)殖用水中孔雀石綠及其代謝物、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素殘留，液相色譜-質譜法定量、定性檢測的分析方法[15]，實驗證明，此方法靈敏度高、重復性好，可以用于水產養(yǎng)殖用水中孔雀石綠及其代謝物、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素殘留的監(jiān)測。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-30A型超高壓液相色譜儀（日本SHIMADZU公司）；LCMS-8030型三重四級桿串聯(lián)質譜儀（日本 SHIMADZU公司）；博納艾杰爾Qdaura SPE-40型全自動固相萃取儀（天津Agela Technologies公司）；梅特勒ME 203E型電子天平（萬分之一，瑞士mettler-toled公司）；L-148型水浴氮吹儀（北京來亨科技公司）；沃特世HLB固相萃取柱（規(guī)格：500 mg，12 mL，美國 Waters公司）；QL-901型渦旋振蕩器（上海書培實驗設備公司）；Milliplus 2150型超純水系統(tǒng)（美國millipore公司）。

孔雀石綠標準溶液：編號為1ST7301-100M，濃度為100 μg/mL；隱色孔雀石綠標準溶液：編號為1ST7303-100M，濃度為 100 μg/mL；氧氟沙星標準溶液：編號為 BWQ8055-2016，濃度為 100 μg/mL；恩諾沙星標準溶液：編號為1ST4107-100M，濃度為100 μg/mL；土霉素標準溶液：編號為 1ST4111-100M，濃度為100 μg/mL，均購自北京北方偉業(yè)計量技術研究院。

乙酸銨、甲酸：分析純，含量均大于99.0%，購自國藥集團上海化學試劑廠；甲醇、乙腈：色譜純，含量均大于99.999%，購自美國天地試劑公司；實驗所有用水均為超純水。

1.2 溶液制備

1.2.1 標準儲備溶液的制備

取孔雀石綠標準溶液（濃度為100 μg/mL），準確移取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得孔雀石綠標準儲備溶液（濃度為10 μg/mL）；同法取隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素標準溶液，制備隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素標準儲備溶液（濃度均為10 μg/mL）。

1.2.2 系列標準溶液的制備

分別取1.2.1孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素標準儲備溶液，精密吸取適量，置同一支50 mL容量瓶中，加甲醇制備每1 mL溶液含有孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素分別為 0.002，0.02，0.2，1.0，2.0，4.0 μg的混合標準溶液，即得系列標準曲線溶液。

1.2.3 樣品溶液的制備

樣品收集：隨機在水產養(yǎng)殖廠采集水產養(yǎng)殖水樣2 L，過濾，去除肉眼可見異物，置棕色容量瓶中，儲存條件4 ℃，該溶液在24 h內有效。

前處理：取收集后的水樣，調節(jié)水樣溫度至室溫，加0.1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液，調節(jié)pH值至7.0，然后將該水樣倒入固相萃取儀樣品儲存瓶中，置樣品架上；另取HLB固相萃取小柱，按設定的樣品位置，將固相萃取小柱依次置固相萃取儀中，首先將固相萃取小柱進行活化（分別用12 mL純化水、12 mL甲醇和12 mL正己烷活化萃取小柱）；設定程序，將上述水樣 1 L，以 15 mL/min 的流量，過固相萃取柱，最后用15 mL 50%甲醇洗脫，收集洗脫液；最后將洗脫液氮吹至近干（45 ℃條件），再加甲醇定容至1 mL，混勻，即得。

1.3 色譜和質譜條件

1.3.1 色譜方法

色譜柱：Waters Acquity BEH UPLC-C18（規(guī)格：100 m × 2.1 mm, 2.1 μm）；柱溫度：35 ℃；柱流量：0.25 mL/min；進樣體積：10 μL；流動相 A：0.1% 甲酸的水溶液，流動相B：1 mmol/L乙酸銨的甲醇溶液；洗脫模式：梯度洗脫。洗脫表見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質譜方法

掃描方式：ESI+正離子模式；離子源：電噴霧離子源；電噴霧電壓：4500 V；離子源溫度：560 ℃；離子傳輸管溫度：350 ℃；輔助氣壓力：72 psi(1 psi=6.895 kPa)；氣簾氣壓力：31 psi；碰撞氣：氮氣（氮氣發(fā)生器制備）；檢測模式：MRM（多反應監(jiān)測模式）。

2 結果與討論

2.1 前處理方法的確定

水樣中獸藥和禁用藥物殘留監(jiān)測的前處理方法主要有：QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)凈化法、凝膠凈化色譜法和固相萃取法等。QuEChERS凈化法，需要將水樣進行濃縮后進行提取和凈化，濃縮過程易造成目標物的損失或分解，準確度偏低；凝膠凈化色譜法，前處理色譜條件需要優(yōu)化，操作步驟繁瑣，試劑耗用量大，且儀器價格較高，方法適用性較差；固相萃取法，無需對樣品進行濃縮，且操作步驟簡單，準確度較高，方法更易推廣使用。實驗取孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素加標濃度均為0.05 μg/mL的混合溶液，分別采用上述3種方法進行前處理，保持其他條件不變，考察3種前處理方法對檢測結果準確度的影響。結果，凝膠凈化色譜法和固相萃取法回收率優(yōu)于QuEChERS凈化法，考慮到固相萃取法的優(yōu)勢，最終確定固相萃取法為前處理方法。比較結果見表2。

表2 3種前處理方法回收率比較

2.2 固相萃取柱類型的確定

固相萃取柱在整個前處理過程中，對目標物的富集、凈化、洗脫起到關鍵作用，因此選擇適合的固相萃取柱，可以有效提高檢測結果的準確度、降低基質干擾等。孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素5種目標物，其中孔雀石綠、隱色孔雀石綠極性較弱，氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素極性均偏中等強度。實驗分別選擇HLB固相萃取柱、MCX固相萃取柱、C18固相萃取柱和氨基固相萃取柱（規(guī)格均為 500 mg，12 mL），保持其他條件不變，分別更換上述4種類型固相萃取柱，考察對孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素加標濃度均為0.05 μg/mL的混合溶液的回收率影響。結果如表3，選擇HLB固相萃取柱時，5種目標物回收率最佳。因此實驗選擇HLB固相萃取柱作為前處理小柱。

表3 4種固相萃取柱回收率比較

2.3 質譜條件的優(yōu)化

取1.2.1孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素標準儲備溶液，分別配制質量濃度為150 ng/mL的單標測試溶液。分別將上述單標測試溶液，選擇儀器模式為質譜模式，找到5種目標物的母離子，再以合適的碰撞能量將母離子擊碎，得到母離子對應的子離子，選擇響應較高的1個子離子作為定量離子，另選1個子離子作為定性離子，根據(jù)母離子對應的2個子離子對，優(yōu)化碰撞能量和去簇電壓，建立上述5種目標物的MRM監(jiān)測方法。優(yōu)化后的質譜條件見表4。

表4 質譜參數(shù)結果

2.4 標準曲線及檢出限

取 1.2.2 項下 0.002，0.02，0.2，1.0，2.0，4.0 μg/mL的系列標準溶液，按1.3色譜和質譜條件，分別進樣上述系列標準溶液，每個濃度點測定3次，取平均值，再以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，計算回歸方程；最后逐級稀釋標準溶液，以3倍信號噪音比值計算檢出限。結果見表5，典型譜圖見圖1。

表5 標準曲線、回歸方程及檢出限

圖1 典型質譜圖

2.5 回收率試驗

取水產養(yǎng)殖水樣品（樣品&3，本底中恩諾沙星含量為0.039 μg/mL），過200目篩網，去除肉眼可見異物，分別加入適量1.2.1孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素標準儲備溶液，再加0.1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液，調節(jié)pH值至7.0，后續(xù)按1.2.3樣品溶液處理方法進行，制備含孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素濃度分別為 0.002，0.02，2.0 μg/mL 的加標溶液，再按1.3色譜和質譜條件，分別進樣上述加標溶液，每份加標溶液制備5份，扣本底后計算回收率和RSD。結果見表6。

表6 回收率試驗結果

2.6 方法重復性試驗

取水產養(yǎng)殖水樣品，過200目篩網，去除肉眼可見異物，分別加入適量1.2.1孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素標準儲備溶液，再加0.1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液，調節(jié)pH值至7.0，后續(xù)按1.2.3樣品溶液處理方法進行，制備含孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素濃度為0.01 μg/mL的重復性溶液，同法制備6份，再按1.3色譜和質譜條件，分別進樣上述重復性溶液，計算檢測結果的RSD。結果，孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素重復性RSD均在5.0%以內，結果表明方法具有良好的重復性。

2.7 實際樣品的測定

隨機在水產養(yǎng)殖廠采集水產養(yǎng)殖水樣5份，置棕色容量瓶中帶回實驗室，按1.2.3樣品溶液處理方式進行，制備樣品溶液，每份樣品制備3份，再按1.3色譜和質譜條件，分別進樣分析，計算5份不同樣品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素的含量。結果見表7。

表7 實際樣品檢測結果

3 結束語

實驗以水產養(yǎng)殖水為研究對象，結合近年來水產養(yǎng)殖特點，針對孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素5種目標物，建立了采用固相萃取法提取、凈化、洗脫水產養(yǎng)殖水中的上述5種目標物，液相色譜-質譜法定量、定性檢測的分析方法。對方法的前處理方法和固相萃取柱類型進行了確定，考察了方法的線性等參數(shù)，并根據(jù)創(chuàng)建的方法對水產養(yǎng)殖水進行了檢測應用，實驗結果證明，此方法檢出限低、操作步驟簡單、檢測結果準確，適用于水產養(yǎng)殖水中極微量殺菌劑、抗生素等殘留的檢測。