miR-430對斑馬魚原始生殖細胞遷移和性腺發育影響的初步研究?

林小涵， 金超凡， 高 晨， 汪 波??， 賀 艷，2， 齊 潔，2， 張全啟，2

(1. 中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室， 山東 青島 266003；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室， 山東 青島 266237)

生殖細胞是多細胞生物體內能繁殖后代的細胞的總稱，包括PGCs及其分化后形成的生殖細胞。PGCs通過有絲分裂產生，隨后遷移至原始性腺形成的區域，也就是生殖嵴，通過進一步的分化形成精原細胞或卵原細胞，最終分化生成成熟的卵子和精子。

miRNA是內源性的非編碼小RNA，含有18～25個核苷酸，以序列特異性的方式參與轉錄后基因的表達調控，通過識別和招募蛋白復合物結合到靶基因的 3′UTR來抑制翻譯或影響mRNA穩定性，在細胞增殖、分化以及器官發育等多種生物學過程中發揮關鍵作用[1]。其保守的種子區由5′端的第2～7位核苷酸組成，是靶向配對過程中的決定因子[2]。單個miRNA可以結合多個靶mRNA，因此每個miRNA均可以參與并調節多種生物學過程[3]。

miRNAs在生殖細胞發育過程中扮演著十分重要的角色，主要參與PGCs的分化、生殖細胞的維持及發育過程，這在之前的研究中已經得到了廣泛的證明。在果蠅PGCs遷移分化過程中，miR-6和miR-9能夠影響vasa和nanos的表達，這些基因都是關鍵的生殖質組分[4]。在生殖細胞的維持及分化過程中，miRNA同樣發揮著十分重要的功能。例如在生殖干細胞自我更新時，miRNA在有絲分裂的G1期向S期轉換的過程中，通過抑制細胞周期抑制因子dap來促進生殖干細胞的有絲分裂進程，進而促進生殖干細胞的自我更新[5]。此外，果蠅中的miR-184可以調控sax受體表達，進而影響雌性生殖細胞的發育和分化過程[6]。在小鼠中，miR-122a主要在晚期雄性生殖細胞中表達，抑制精子發生過程中特異性表達的mRNA。

盡管miRNAs的功能得到了廣泛的證實，但是在魚類中的研究還較少，大部分都在斑馬魚和青鳉等模式生物中進行[7-9]。miR-430家族最初是在硬骨魚中被發現和鑒定，該家族在脊椎動物中高度保守，與其他脊椎動物miRNAs在進化上密切相關。在斑馬魚中，miR-430家族在受精卵中合子基因轉錄開始時表達，是合子基因組中最早轉錄且轉錄水平最高的基因簇之一[10]，能直接調控數百個靶基因。其中，大多數靶基因是母源基因，在缺失miR-430的情況下會在細胞中積累[11]。在斑馬魚胚胎發育的過程中，miR-430參與維持PGCs特異性表達基因的調控。例如，miR-430可靶向體細胞中的nanos和tdrd7基因，降低它們mRNA的穩定性并且抑制其翻譯，從而維持它們在PGCs生殖質中的特異性表達和分布[8]。此外，miR-430還影響趨化因子sdf1a和cxcr7b的表達，通過降解原表達域內的sdf1amRNA來調節其表達量和分布范圍，同時調節cxcr7b的表達水平以避免sdf1a過度消耗，確保PGCs的準確遷移[12]。但是斑馬魚PGCs遷移到生殖嵴之后，在其向成熟的生殖細胞分化以及性腺發育的過程中，miR-430的功能還未得到探究。

本研究以斑馬魚為實驗對象，通過上調miR-430的表達探究其對斑馬魚PGCs的形成、遷移、生殖細胞發育以及性腺發育的影響。研究發現過表達miR-430會導致斑馬魚PGCs遷移紊亂，并且造成nanos3等生殖細胞標記基因mRNA表達量的顯著下調。通過組織學觀察發現過表達miR-430會造成卵母細胞發育異常，卵巢發育遲緩，但不影響斑馬魚的性別分化以及精巢的發育。

1 材料方法

1.1 材料

本實驗所用斑馬魚包括野生型AB品系以及CZ18品系，均購買于國家斑馬魚資源中心。其中CZ18品系為kop：EGFP-UTR-nanos3轉基因斑馬魚，其PGCs可特異性表達綠色熒光蛋白(EGFP)。成魚飼養在自動水循環系統中，水溫控制在28 ℃，光周期為14 h光照/10 h黑暗，喂食鹵蟲或魚飼料(每天3～4次)。斑馬魚受精卵放置于斑馬魚胚胎培養液中，在28 ℃恒溫條件下孵育，孵化后在靜水中飼養一個月，而后轉移至水循環系統中喂養。

1.2 方法

1.2.1 顯微注射和熒光檢測 miR-430 mimic (5′-UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU-3′)和Control miRNA (5′-UAACACGUCUAUACGCCCA-3′)由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；LNA-430 (5′-ACAGGCCGGGACAAUGCAAUA-3′)由EXIQON公司合成，其與miR-430有較高的結合親和力，用于抑制miR-430的功能。在斑馬魚胚胎1細胞時期進行顯微注射，其中miR-430 mimic和LNA-430的注射濃度均為5 μmol/L。

使用尼康SMZ1500體視顯微鏡在胚胎不同發育階段觀察和跟蹤PGCs的形成以及定位。

1.2.2 實時熒光定量PCR 在受精后12 h收集30枚AB品系斑馬魚胚胎，每個處理重復取樣3次，用PBS清洗后轉移至RNA wait中，4 ℃保存。按照說明書用TRIzol法提取斑馬魚胚胎RNA，使用g-eraser反轉試劑盒(寶生物工程有限公司)合成cDNA。

用Primer5設計定量引物，選擇β-actin作為內參基因，本研究所用引物詳見表1。使用寶生物工程有限公司的2xSYBR Green PCR Master Mix試劑和羅氏Lightcycler 480 PCR儀進行實時熒光定量PCR擴增。采用2-ΔΔCt法計算基因的拷貝數，用SPSS 2.0進行顯著性分析。

表1 本研究所用引物

1.2.3 報告載體構建 從NCBI數據庫獲取nanos3的基因序列，設計帶有酶切位點的引物擴增nanos3的3′UTR區域，將其克隆至pMD-19T載體，驗證序列正確性后，用XhoⅠ和HindⅢ酶對nanos33′UTR和EGFP-N1質粒進行雙酶切，連接、轉化后測序獲得EGFP-nanos33′UTR報告載體。用XhoⅠ酶線性化報告載體后，按照Message Machine SP6試劑盒(賽默飛公司)的指示在體外合成mRNA。

1.2.4組織切片 為檢測過表達miR-430對斑馬魚性腺發育的影響，分別在30、60和100時取斑馬魚性腺樣品，每個處理組隨機取30尾斑馬魚樣品。放在4%多聚甲醛中過夜保存，隨后梯度甲醇脫水，-20 ℃保存。將樣品切成2～3 mm3的小塊，經脫水、透明后進行石蠟包埋，使用徠卡RM2016切片機切片，分別在60和37 ℃條件下展片和烘片，在脫蠟、脫水后進行切片染色和封片。使用尼康AZ100熒光顯微鏡觀察不同發育時期的斑馬魚性腺切片結果。

2 結果

2.1 過表達miR-430影響PGCs遷移

為檢驗合成的miR-430能否影響PGCs的形成及遷移，本文作者將miR-430 mimic注射到CZ18品系斑馬魚的1細胞時期的胚胎中，使用熒光顯微鏡檢測PGCs的形成和遷移情況。檢測結果表明miR-430不影響PGCs的正常形成，但在原腸晚期發現過表達miR-430的胚胎中PGCs的遷移發生紊亂，多數PGCs分散成單個細胞進行遷移運動(見圖1a’)，而對照組胚胎中的PGCs以體軸為中心聚集成兩簇進行遷移(見圖1e’)。在胚胎發育至受精后20 h時，miR-430過表達的胚胎中PGCs的排列更為分散，排成一列向生殖嵴遷移(見圖1b’)。在受精后24 h時，對照組中PGCs簇已經遷移至生殖嵴附近(見圖1g’)，而過表達miR-430的胚胎中部分PGCs遷移至卵黃延伸部的尾端，定位在生殖嵴以外的區域(見圖1c’)。受精后36 h時PGCs遷移已經結束，對照組中PGCs聚集在生殖嵴區域(見圖1h’)，相較于對照PGCs的緊密分布，過表達組胚胎中PGCs排列松散，并且部分PGCs定位在卵黃延伸部的尾端(見圖1d’)。本文作者還對PGCs的遷移情況進行了統計分析(見圖1B)，結果表明過表達組中有86%的胚胎出現PGCs遷移紊亂的表型，顯著高于對照組。

(A. 注射miR-430 mimic和Control miRNA的胚胎中PGCs的遷移情況。a～d分別為受精后9、20、24和36 h miR-430 mimic注射組胚胎(白光)；a’～d’分別為受精后9、20、24和36 h miR-430 mimic注射組胚胎(熒光)；e～h分別為受精后9、20、24和36 h對照組胚胎(白光)；e’～h’分別為受精后9、20、24和36 h對照組胚胎(熒光)。箭頭指示遷移中的PGCs。B. 注射miR-430 mimic和Control miRNA后表型統計，每組處理分別統計了200枚胚胎。數據代表平均值±誤差； 表示p < 0.01。A. PGCs migration in embryos injected with Control miRNA and miR-430 mimic. a～d: Embryos from miR-430 mimic injected group at 9, 20, 24 and 36 h post fertilization (white light); a’～d’: Embryos from miR-430 mimic injected group at 9, 20, 24 and 36 h post fertilization (fluorescent light); e～h: Embryos from control group at 9, 20, 24 and 36 h post fertilization (white light); e’～h’: Embryos from control group at 9, 20, 24 and 36 h post fertilization (fluorescent light). Arrows indicate PGCs in migration. B. Phenotype statistics after injection of Control miRNA and miR-430 mimic, 200 embryos were examined for each group. The data represent the mean ±SD (error bars); indicates p<0.01.)

隨后，通過實時熒光定量PCR檢測了過表達miR-430對生殖細胞特異性表達基因nanos3、piwil2和tdrd7的影響。實驗結果如圖2所示，在PGCs遷移的關鍵時期，miR-430的過表達會引起內源nanos3、piwil2和tdrd7mRNA表達水平的顯著下調。在確定miR-430影響靶基因的表達后，通過將LNA-430、miR-430 mimic和Control miRNA分別與體外合成的EGFP-nanos33′UTR混合后共注射斑馬魚受精卵，進一步探究了過表達和抑制miR-430的表達對其靶基因nanos3表達和分布的影響。在受精后36 h時，熒光檢測發現對照中綠色熒光蛋白可以在生殖細胞中表達，并且生殖細胞簇定位在生殖嵴(見圖3C、C’)。在注射LNA-430的處理組中(見圖3A、A’)，觀察到斑馬魚全身熒光相對于對照組增強，并且無法準確辨認被標記的PGCs。在共同注射EGFP-nanos33′UTR和miR-430 mimic組中(見圖3B、B’)，斑馬魚體內的綠色熒光明顯弱于以上兩個處理組，并且發現PGCs遷移紊亂，部分PGCs定位于生殖嵴以外的區域。

(數據代表平均值±SD(誤差棒)；表示p<0.01。The data represent the mean ±SD (error bars); indicates p<0.01.)

(A和A’代表共注射LNA-430和EGFP-nanos3 3′UTR的斑馬魚；B和B’代表共注射miR-430 mimic和EGFP-nanos3 3′UTR的斑馬魚；C和C’代表共注射Control miRNA和EGFP-nanos3 3′UTR的斑馬魚。箭頭指示PGCs的定位。A and A’ represent zebrafish injected with LNA-430 and EGFP-nanos3 3’UTR; B and B’ represent zebrafish injected with miR-430 mimic and EGFP-nanos3 3’UTR; C and C’ represent zebrafish injected with Control miRNA and EGFP-nanos3 3’UTR. Arrows demonstrate the location of PGCs.)

2.2 miR-430對性腺發育和性別分化的影響

為了進一步探究miR-430對斑馬魚性腺發育的影響，向AB品系斑馬魚受精卵中注射miR-430 mimic，制備受精后第30、60和100天的性腺組織切片并進行觀察分析(見圖4A、B)。受精后第30天的對照組和實驗組切片結果表明，斑馬魚性腺發育正常，此時性腺未出現明顯的雄魚特征，均表現為雌性特征。卵母細胞處于初級生長期，卵母細胞發育正常，和對照相比沒有明顯區別。對2月齡斑馬魚性腺組織切片的觀察發現，在注射miR-430的斑馬魚中，雄魚性腺和對照組并無區別；對照組的卵母細胞處于從初級生長期向卵黃發生期過渡的階段，而過表達組的卵巢發育明顯滯后，卵母細胞數目少且發育異常，細胞形態不完整。在受精后第100 天時，斑馬魚已經性成熟，精巢中有大量精細胞形成，同時可以觀察到精原細胞和精母細胞；此時卵母細胞進入成熟期，卵黃顆粒基本充滿卵母細胞，而過表達miR-430組的卵母細胞發育略有滯后，其內部的卵黃顆粒數目明顯少于對照組卵黃顆粒數目。

(A. 受精后第30、60和100天對照組和miR-430 mimic注射組斑馬魚的卵巢切片；B. 受精后第60和100天對照組和miR-430 mimic注射組斑馬魚的精巢切片。PO為初級生長期卵母細胞，PVO為卵黃發生前卵母細胞，VO為卵黃發生期卵母細胞，MO為成熟卵母細胞，SG為精原細胞，SP為精母細胞，SD為精細胞。標尺均為20 μm。A. Ovarial histology examination of zebrafish from control group and miR-430 mimic injected group at 30, 60, and 100 d post fertilization; B. Spermatic histology examination of zebrafish from control group and miR-430 mimic group at 60, and 100 d post fertilization. PO, primary-growth oocyte; PVO, previtellogenic oocyte; VO, vitellogenic oocyte; MO, mature oocyte; SG, spermatogonia; SP, spermatocyte; SD, spermatid. Scale bar=20 μm.)

另外，在受精后第100 天時對斑馬魚性腺的大小進行了進一步分析測定，解剖觀察結果如圖5所示，注射miR-430組雄魚的精巢和對照組雄魚的精巢形態與大小不存在明顯差異；而注射miR-430的雌魚的卵巢明顯發育不良、體積偏小，約為對照組卵巢體積的二分之一。

圖5 受精后100 d的斑馬魚性腺

在出生后第100天，已經可以通過表觀特征群區分斑馬魚的雌雄，雄魚的胸鰭表面存在鋸齒狀突起(見圖6A)，雌魚的胸鰭表面光滑(見圖6B)。在顯微鏡下觀察斑馬魚胸鰭鑒定雌雄比例，發現miR-430注射組雄魚胸鰭表面鋸齒狀突起較少(見圖6C)且沒有對照組明顯。統計結果顯示：miR-430注射組23.5%雄魚，76.5%雌魚；對照組24.0%雄魚，76.0%雌魚，表明斑馬魚的性別分化不受miR-430的影響。

(A和B分別代表對照組雄性和雌性斑馬魚胸鰭；C和D分別代表miR-430過表達組雄性和雌性斑馬魚胸鰭。A and B: Pectoral fins of male and female zebrafish in the control group; C and D: Pectoral fins of male and female zebrafish in the miR-430 overexpression group.)

3 討論

在本研究中，發現miR-430的過表達會引起斑馬魚PGCs遷移的紊亂，致使部分PGCs無法正常遷移至生殖嵴，并且導致nanos3等PGCs特異性表達基因mRNA水平降低。在生殖細胞發育過程中，上調miR-430可以抑制卵母細胞的發育，并且造成卵巢發育遲緩，但是對斑馬魚精巢發育及性別分化沒有明顯影響。

miR-430此前已被證明在PGCs遷移中發揮關鍵作用，miR-430及其哺乳動物同源基因miR-302均可拯救miRNAs缺失突變體中的PGCs異位表型，miR-430能夠通過調節趨化因子sdf1a和cxcr7bmRNA的表達確保PGCs的準確遷移[12]。本研究通過注射miR-430 mimic在斑馬魚胚胎中過表達miR-430，同樣發現PGCs的定位出現異常，從另一個角度探究了miR-430對PGCs遷移的影響。在斑馬魚中，PGCs的形成由生殖質這種特殊的母源性細胞質決定[13]，一些母源mRNA，如dnd、vasa和nanos3等定位于生殖質中，這些mRNA隨著胚胎發育被整合進入體細胞和PGCs。miR-430在受精卵中合子基因轉錄開始時就大量表達[7]，由于受到miR-430介導的mRNA去烯化、mRNA降解和翻譯抑制，部分生殖質基因在體細胞中會被迅速降解。在PGCs中，其靶mRNA也受到miR-430的調控[11]，但nanos3和tdrd7mRNA 3′UTR中的順式作用元件能補償miR-430介導的抑制作用，使這些mRNA能在PGCs中穩定存在。此外，近些年的研究發現，一些生殖系特異性RNA結合蛋白也在維持生殖質基因的特殊表達模式中發揮重要作用。其中，dnd1可以通過結合mRNA以及阻止miRNAs與靶位點的相互作用，來抵消斑馬魚PGCs中miR-430等miRNAs的功能[14]；DAZL能與tdrd7結合，通過誘導poly (A)尾部的伸長(聚腺苷酸化)來緩解miR-430介導的對tdrd7mRNA的抑制[15]。這些機制共同作用，保證了nanos3和tdrd7等基因在PGCs中的穩定表達和功能發揮。在本研究中，miR-430的過表達會進一步加劇其對體細胞中靶mRNA的抑制作用，并且超出了PGCs中nanos3和tdrd7等基因的順式作用元件以及DAZL和dnd等保護機制對miR-430介導的降解的補償范圍，進而導致這些生殖質基因在PGCs中表達量減少。

斑馬魚中已有的研究顯示nanos3的正常表達對于PGCs的遷移和存活至關重要，敲降nanos3會造成部分PGCs的錯誤定位[16]。本研究結果證明過表達miR-430可導致內源nanos3表達的下調以及外源nanos33′UTR的分布和定位變化，和已有的研究結果是一致的。表明miR-430可以通過調控PGCs中nanos3等生殖質基因的表達，參與調節PGCs的遷移運動。

魚類的卵泡發育和卵母細胞成熟受下丘腦、垂體和卵巢產生的激素控制[17]，卵母細胞的成熟是在卵泡刺激素(LH)、成熟誘導激素(MIH)和成熟促進因子(MPF)三種主要調節因子的控制下發生的[18]。近些年來，多項研究證明有多種miRNAs通過轉錄后調控在硬骨魚類的卵母細胞發育、成熟以及卵子發生等過程中發揮作用。青鳉miR-202在卵子發生/卵泡發生中的起到關鍵作用，敲除miR-202導致早期卵泡發育受損，卵子數量減少[19]。斑馬魚23號染色體上的miRNA-200簇是卵母細胞成熟和排卵所必需的[20]。已有研究在斑馬魚卵泡細胞中檢測到了miR-430b，認為miR-430b可能參與調控斑馬魚卵母細胞的成熟[21]。

斑馬魚的性腺發育一般從出生后第30天開始，在性別分化之前，所有性腺均發育為卵巢；在出生后第40～50天期間，性腺開始分化；當發育到第60天時，性腺分化結束，卵巢和精巢形成。已有的研究表明，足夠數量的早期生殖細胞對雌性斑馬魚的性發育至關重要，斑馬魚早期胚胎中生殖細胞的缺失，會導致斑馬魚發育為雄性[22]。本研究結果表明，過表達miR-430會影響斑馬魚卵母細胞的正常發育，并導致卵巢發育遲緩，但不影響斑馬魚的性別分化。由于PGCs在遷移到生殖嵴后能與體細胞共同形成原始性腺，并最終增殖分化形成兩性配子，PGCs的正常遷移和準確定位是其功能發揮的前提條件。因此，本文作者推測過表達miR-430導致部分PGCs不能正常遷移至生殖嵴，造成定位于生殖嵴的PGCs數目減少，進而影響了后續卵巢的正常發育。

綜上所述，本研究對miR-430在斑馬魚生殖細胞發育中的功能進行了初步探究。證明過表達miR-430會造成PGCs遷移紊亂，miR-430可能通過影響PGCs中nanos3、piwil2和tdrd7等生殖質基因的表達及定位，在PGCs遷移過程中發揮關鍵作用。另外，在胚胎發育早期上調miR-430還會將會影響性腺分化時期卵母細胞的正常發育，導致卵巢發育遲緩。上述結果為后續研究miR-430在PGCs遷移和生殖細胞發育中的分子調控奠定了基礎。