鹽脅迫對間歇增氧垂直流人工濕地脫氮性能及微生物群落影響?

宋利國， 宋維星， 王宜東， 周衍平， 洪 波， 季軍遠??

(1. 中國海洋大學海洋環境與生態教育部重點實驗室， 山東 青島 266100；2. 中國海洋大學山東省海洋環境地質工程重點實驗室， 山東 青島 266100；3. 山東高速服務開發集團有限公司， 山東 濟南 250000)

人工濕地屬于生態水處理系統，主要通過微生物的硝化反硝化以及植物吸收作用實現廢水脫氮[1]。微生物硝化過程需要氧氣作為電子受體，人工濕地中的氧氣主要來源于大氣自然復氧、水體更新復氧和植物根系泌氧[2]，而三者提供的氧氣含量有限，使得硝化反應進程受限。雖然垂直潛流人工濕地比水平潛流人工濕地氧氣傳輸速率更高，但仍無法滿足濕地脫氮過程中對氧氣的需求，對TN的去除率也僅為30%～40%左右[3]，極大限制了其在廢水脫氮領域的推廣及工程應用[4]。濕地植物對廢水中氮污染物的去除主要通過根系吸收作用，傳統垂直流人工濕地中植物根系多呈分散生長，與廢水接觸面積有限，這直接影響植物吸收氮污染物的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

新型間歇增氧垂直流人工濕地見圖1。濕地為有機玻璃制成的圓柱體，內徑30 cm，高80 cm。距底部45 cm處設有法蘭和密封蓋板。將濕地分為上下兩部分，下部自下而上依次填充粒徑30～50 mm的粗礫石(高度10 cm)、粒徑10～20 mm的細礫石(高度15 cm)、粒徑5～10 mm的煤渣(高度20 cm)；濕地上部由同心多孔圓環板分成三個區域，最內為內徑5 cm的曝氣區，底部開口與濕地下部貫通，放置曝氣頭進行人工曝氣，由氣體流量計控制曝氣流量，繼電器控制曝氣泵啟閉，向外為沙土降解區，由內徑14、19和26 cm三層擋板構成，填充粒徑1～3 mm沙土(高度25 cm)，濕地植物蘆葦種植在內徑14和19 cm擋板組成的圓環區域內，目的是限制根系發散生長，形成根系屏障墻，充分發揮根系吸收作用和泌氧能力，促進氮污染物去除；最外側為出水區，廢水經濕地處理后由出水口排出。

圖1 間歇增氧垂直流人工濕地系統

1.2 試驗廢水

表1 微量元素溶液組成成分

1.3 濕地系統運行

濕地系統采用連續進水方式，由濕地底部進水，上部出水，進水流量為10 L/d，HRT設定為48 h，間歇曝氣過程采用前期試驗所獲取的最優曝氣參數，即曝氣量2 m3/h、曝停周期6 h、曝停比0.25。繼電器控制曝氣泵啟閉。

1.4 分析指標及測定方法

PCR擴增及高通量測序：將對人工濕地定點取樣后，采用Power Soil DNA Isolation Kit，按照操作提取樣品中DNA，使用1%(質量分數)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質量。采用細菌16S rRNA基因V3+V4擴增區域，引物為341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)，對DNA進行PCR擴增，擴增體系及擴增條件按文獻[12]方法進行。PCR擴增產物使用OMEGA膠回收純化試劑盒純化后4 ℃保存。最后交由基質取樣后進行超聲、離心預處理，預處理后的樣本交由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行DNA提取和測序。利用Illumina HiSeq高通量測序技術在HiSeq 2500系統進行測序。

2 結果與討論

2.1 鹽度對人工濕地中污染物去除性能影響

表2 不同鹽度和進水濃度下各污染物去除情況

圖2 鹽度對出水濃度(a)和去除率(b)的影響

圖3 鹽度對和出水濃度的影響

圖4 鹽度對TN出水濃度(a)和去除率(b)的影響

圖5 鹽度對出水COD濃度(a)和去除率(b)的影響

2.2 鹽度對人工濕地微生物群落影響

2.2.1 生物樣品測序結果與深度驗證 8個樣品經過測序后，得到的有效序列數平均為59 101個。按97%的一致性將序列聚類為OTUs，共得到1 915個OTUs，將得到的OTUs序列與Sliva數據庫進行物種的比較注釋，共有1 482個可以注釋到屬水平。稀釋曲線可以直觀反映測序數據的準確性并在一定程度上間接反映物種多樣性，樣品的稀釋曲線見圖6。由圖6可知，樣品的測序量均在40 000后已經趨于平緩，更多的測序量僅產生少量的OTUs，說明數據合理，測序深度足以包含樣本中絕大部分的微生物物種。提高鹽度以后的CW2-P1、CW2-P2、CW3-P1、CW3-P2、CW4-P1和CW4-P2樣本稀釋曲線對應的OTUs均較無鹽工況(CW1-P1、CW1-P2)大，說明各鹽度下物種多樣性均有所提高。

圖6 微生物樣品稀釋曲線

2.2.2 鹽度對微生物豐富度和多樣性影響 ACE指數和Chao1指數、Simpson指數和Shannon指數可分別表征微生物群落豐富度與多樣性，ACE、Chao1指數數值越高，代表物種豐富度越高，Simpson和Shannon指數數值越高，代表物種多樣性越高。生物樣品多樣性分析結果見表3，從表3中可知，8個生物樣品物種覆蓋率(Coverage)均高于99.5%，表明基質樣品中絕大多數物種均涵蓋在高通量測序中，測序結果可準確完整地反映濕地微生物樣品的真實情況。

表3 微生物樣品的Alpha多樣性指數分析

由表3分析得出，8個基質樣品中，0.5%鹽度(CW2-P1、CW2-P2)、1.0%鹽度(CW3-P1、CW3-P2)、2.0% 鹽度(CW4-P1、CW4-P2)下樣品微生物的ACE指數、Chao1指數均高于無鹽(CW1-P1、CW1-P2)下樣品微生物的ACE指數、Chao1指數，各鹽度下樣品中微生物的物種總數、菌落豐富度均較無鹽下顯著增大。濕地植物沙土區(P1)的4個樣品(CW1、CW2、CW3、CW4)微生物的ACE指數、Chao1指數以0.5%鹽度下(CW2)為最高，分別為1 260.387、1 222.439；曝氣底部填料區(P2)的4個樣品(CW1、CW2、CW3、CW4)微生物的ACE指數、Chao1指數以0.5%鹽度下(CW2)為最高，分別為1 349.208、1 322.524，0.5% 鹽度下樣品微生物的菌落豐富度最高。各鹽度下曝氣底部填料區樣品微生物的ACE均高于濕地植物沙土區，但隨鹽度增加，ACE指數差異減小，曝氣底部填料區微生物豐富度較濕地植物沙土區更高。

8個基質樣品中，0.5%、1.0%和2.0%鹽度下樣品微生物的Simpson指數、Shannon指數均低于無鹽工況，兩個指數的最低值均出現在0.5%鹽度下，隨鹽度提升，Simpson指數、Shannon指數均逐步增大。無鹽工況下樣品微生物的多樣性指數最高，初期過渡到鹽環境下微生物的多樣性呈劇烈變化，且出現大幅降低，但此鹽度(0.5%鹽度)下微生物的均勻度最高；隨微生物對鹽度的逐步適應，微生物多樣性又恢復至無鹽工況水平，表明鹽度對人工濕地系統微生物菌群分布及其多樣性產生了顯著影響。各鹽度下曝氣底部填料區樣品微生物的Simpson指數、Shannon指數均高于濕地植物沙土區樣品，但隨鹽度增加，兩者之間Simpson指數、Shannon指數差異均縮小，0.5% 鹽度下兩者的Simpson指數、Shannon指數的差異最大，隨鹽度提升，兩者的微生物多樣性均有所增加，且兩者差異逐步減小。

2.2.3 鹽度對微生物群落結構的影響 為探究鹽度對人工濕地內微生物群落結構影響，在物種門、綱、屬不同水平上進行分類，結果見圖7。

圖7 微生物不同水平分布

從圖7可見，不同鹽度的8個基質樣品(CW1-P1、CW1-P2、CW2-P1、CW2-P2、CW3-P1、CW3-P2、CW4-P1、CW4-P2)優勢細菌群落在門類水平上達到8門以上(見圖7A)，其中以變形菌門(Proteobacteria)、藍細菌(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)為主，在總序列中的占比為96.1%，其中對氮污染物去除占主要作用的為變形菌門，變形菌屬于革蘭氏陰性菌，多為兼性或專性厭氧菌，是COD去除和脫氮過程的重要貢獻者[25]，其在P1(濕地植物沙土區)的4個基質樣品中的平均豐度為86.7%，在P2(曝氣底部填料區)的4個基質樣品中的平均豐度為85.9%，說明濕地植物區更利于變形菌門生長繁殖。同時由圖7A可見，8個基質樣品中變形菌門在鹽度的變化下豐度保持相對穩定，說明其具有一定的耐鹽性。在綱類水平上(見圖7B)，優勢菌群以γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)為主，其中γ-變形菌綱作為典型的氨氧化細菌[26]，在8個基質樣品中的平均豐度為80.4%，且在濕地植物沙土區中的相對豐度(81.0%)同樣略高于曝氣底部填料區(79.8%)。在屬水平上(見圖7C)，樣品中微生物優勢菌群有鐵氧化菌屬(Ferritrophicum)、硫發菌屬(Thiothrix)等，另有大部分屬于不可培養細菌(Others)，也為進一步濕地中微生物資源的開發利用提供方向。

在鹽脅迫下一些非脫氮菌屬也發生了豐度變化。Ferritrophicum參與鐵氧化過程，對鐵及碳、氮、磷等元素的生物地球化學循環具有重要意義，在各個鹽度下均占據優勢地位。Thiothrix作為菌膠團附著的載體，在無鹽度下豐度低于10%，在0.5%鹽度下豐度大幅提高至71%，使樣品中微生物豐富度顯著提升；隨著鹽度繼續提升，該菌豐度有所下降，但仍維持在50%左右，表明鹽脅迫會促進硫發菌屬生長繁殖。從圖7C中可得出，CW1-P2菌種分布最為均勻，而表3中CW1-P2也具有最大的Simpson和Shannon指數，證實此鹽度下的微生物多樣性最大，而CW2-P1中的Thiothrix占比高達71%，其他菌種總豐度不足30%，對應的表3中CW2-P1的Simpson和Shannon指數最小。

3 結論

(2) 不同鹽度、濕地不同區域(水生植物沙土區、曝氣底部填料區)微生物的種群和相對豐度差別較大，0.5%、1.0%、2.0%鹽度下濕地微生物豐富度均高于無鹽工況，且0.5%鹽度下微生物豐富度最高；各鹽度下曝氣底部填料區微生物豐富度均高于濕地植物沙土區；鹽脅迫初期(0.5%鹽度)濕地微生物多樣性較無鹽下顯著降低，但隨著對鹽脅迫環境的逐步適應，微生物多樣性初步恢復并接近無鹽工況水平。鹽度對人工濕地系統微生物菌群分布及其多樣性產生了顯著影響。

(3) 微生物在門分類水平上是以變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)為共有的優勢菌門，在綱分類水平上以γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)為主。屬分類水平上，隨著鹽度由0.0%提升至2.0%，氨氧化細菌(Nitrosomonas)、亞硝酸鹽氧化細菌(Nitrospiraceae)平均豐度均降低，分別由2.5%、1.7%降至0.5%、0.3%，表明其對鹽度的耐受能力較差；具有反硝化功能的Thiobacillus和Denitratisoma平均豐度較高(分別為11.6%、5.4%)且保持相對穩定，表明其對鹽脅迫具有較好的耐受性。