精脒對老齡小鼠股骨微結構的影響

蘇靜克，蘇靜華，韓 寧，田蕭羽，黨瑞杰，馮 晉，耿燕秋

骨質疏松癥是一種常見的代謝性骨病，多發于老年人和絕經后女性，骨質疏松患者的支持性骨小梁數目減少、質量下降，極易發生骨折。隨著我國人口老齡化的不斷加深，老齡性骨質疏松癥的患病率呈上升的趨勢，防治老齡性骨質疏松對于提高老年人的生活質量具有重要意義。目前治療骨質疏松的藥物主要有雌激素替代物，選擇性激素受體調節劑，二膦酸鹽和降鈣素等。由于這些藥物的臨床效果有限，而且諸如閉經、子宮內膜癌、皮疹、房顫等副作用限制了其臨床應用。因此，迫切需要尋找對于防治骨質疏松安全且有效的替代藥物。精脒(Spermidine)是一種廣泛分布于自然界的多胺類化合物。既往動物實驗發現， Spermidine能延長小鼠壽命并緩解老年性心肌肥大，通過激活AMPK緩解非酒精性脂肪肝病，減緩老齡果蠅的記憶下降。臨床研究也表明，隨著年齡增長，體內的Spermidine水平呈下降趨勢；而且增加含Spermidine豐富食物的攝入能降低因心血管疾病和腫瘤導致的死亡。但Spermidine能否緩解老齡性骨質疏松臨床研究較少。本研究擬探討Spermidine對老齡小鼠股骨微結構的影響，為臨床上防治老年性骨質疏松提供新靶點及新藥物。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器 選取21月齡雄性SPF級C57BL/6J老齡小鼠20只，體質量27～33 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。Spermidine購自美國Sigma公司； 骨源性堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)試劑盒(美國MyBioSource公司)；LabMaster 呼吸代謝分析系統(德國 TSE 公司)；AU5800型全自動生化分析儀(美國BeckMan公司)；2104 Envision多功能酶標儀(美國PerkinElmer公司)；micro-CT(瑞士SCANCO公司)。

1.2 動物分組及干預 小鼠在解放軍總醫院實驗動物中心清潔級環境中喂養，環境溫度(24±1)℃，相對濕度(65±5)%，光照12 h/d。所有動物單籠飼養，自由進食水。動物購回后首先適應性喂養7 d，然后按體重大小排序，奇數納入對照組(Vehicle，=10)，偶數納入實驗組(Spermidine，=10)。Spermidine組老齡小鼠在飲水中3 mmol/L的spermidine，劑量參照文獻[7]，干預時間為12周。

1.3 體質量測量與生化指標檢測 每周測量1次各組小鼠的體質量。干預結束前24 h，將兩組小鼠置于呼吸代謝籠中，禁食但不禁水，然后收集全部尿液。1500 r/min轉速離心3 min，吸取上清液放入液氮中保存。干預結束時，對老齡小鼠按60 mg/kg的劑量腹腔注射1%戊巴比妥進行麻醉，剪毛、消毒皮膚、開胸，直視下心臟取血，快速將血液注入黃帽真空促凝采血管，待血液凝固后析出血清，置于液氮中保存。使用全自動生化分析儀檢測鈣、磷濃度，采用ELISA法檢測血清中骨源性ALP的濃度。

1.4 micro-CT分析股骨微結構 取各只小鼠的右側股骨，清理表面皮膚，剝離附著的肌肉組織，浸入至少20倍體積的4%多聚甲醛液中固定，置于4 ℃環境中保存。老齡小鼠股骨的掃描參數為：電壓80 kV，電流115 μA，分辨率9 μm。選取遠心端股骨生長板最低點0.15 mm厚度的骨質進行三維重建并使用工作站軟件對感興趣的區域(DOI)進行測量分析，分析指標包括：骨小梁相對骨體積(trabecular bone volume per tissue volume, Tb.BV/TV)，骨小梁數目(trabecular number, Tb.N)，骨小梁間隙(trabecular separation, Tb.Sp)，骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)，骨密度(bone mineral density, BMD)，皮質骨厚度(cortical thickness, Ct.Th)，骨外膜周長(periosteal perimeter, Ps.Pm)和骨內膜周長(endosteal perimeter, Es.Pm)。

2 結 果

2.1 Spermidine對老齡小鼠體重的影響 與Vehicle組相比，Spermidine干預全程不影響老齡小鼠的體重，差異無統計學意義(表1)。

表1 Spermidine對老齡小鼠體質量的影響

2.2 Spermidine對老齡小鼠骨代謝相關指標的影響 與Vehicle組相比，Spermidine干預全程不影響尿鈣、尿磷和血磷水平，差異無統計學意義。但Spermidine干預可使老齡小鼠血鈣與血ALP水平顯著升高，差異有統計學意義(<0.05，表2)。

表2 Spermidine對老齡骨代謝相關指標的影響

2.3 Spermidine對老齡小鼠股骨微結構的影響 使用micro-CT對各組老齡小鼠股骨進行掃描重建(圖1A)并對其微結構進行測量分析(圖1B)，結果顯示：與Vehicle組老齡小鼠相比，Spermidine干預明顯提高老齡小鼠的Tb.BV/TV、Tb.N、Tb.Th和BMD，差異均有統計學意義(<0.05)；顯著降低老齡小鼠Tb.Sp(<0.05)；而對Ct.Th、Ps.Pm和Es.Pm無影響，差異無統計學意義。

A.股骨水平面三維重建；B.Tb.BV/TV, 骨小梁相對體積；Tb.N, 骨小梁數目；Tb.Sp, 骨小梁間隙；Tb.Th, 骨小梁厚度；BMD, 骨密度；Ct.Th, 皮質骨厚度；Ps.Pm, 骨外膜周長；Es.Pm, 骨內膜周長,與Vehicle組比較，①P<0.05圖1 Spermidine對老齡小鼠股骨微結構的影響

3 討 論

老齡性骨質疏松是一種衰老退行性疾病，骨形成和骨分解作用均降低，即骨轉換率降低。本研究以老齡小鼠為研究對象，探討Spermidine干預對老齡小鼠骨代謝和股骨微結構的影響，結果發現Spermidine可升高老齡小鼠血鈣與血ALP水平，增加骨小梁的數目并提高骨小梁的質量。正常血鈣、血磷濃度的維持在很大程度上依賴于血液與骨組織之間鈣、磷的相互交換，血鈣、血磷升高往往提示骨合成處于活躍狀態，而尿鈣、尿磷濃度升高則預示著骨分解作用增強。本研究發現，Spermidine干預能升高血鈣水平，但對老齡鼠尿中鈣和磷的水平均無影響，提示Spermidine能促進骨合成，但骨分解代謝無影響。骨合成初期，成骨細胞分泌的膠原纖維交織成網狀。骨合成晚期，礦物鹽沉積在膠原纖維網上形成礦物鹽晶體。ALP可升高骨組織內礦物鹽濃度，促進骨組織礦化。因此，血ALP水平升高提示新骨礦化活躍。本研究發現，Spermidine干預能提高老齡鼠血清中ALP的水平，這從另一個角度證實其能促進骨合成。骨代謝平衡的保持依賴于成骨細胞介導的骨形成作用和破骨細胞介導的骨分解作用，有研究顯示，Spermidine和精胺組成的多胺混合物能通過抑制破骨細胞活性增加去卵巢小鼠的骨量，造成這些研究結果與本實驗結果不同的原因可能是因為該研究使用了與本研究不同的實驗動物模型。有研究表明，限制飲食導致的體重降低會伴隨因鈣、磷攝入不足引起的骨質量下降，本實驗中Spermidine促進骨合成但并不影響老齡小鼠的體質量。

骨折是由于骨強度降低，骨組織抵抗骨折風險能力下降導致的結果，而骨強度又取決于骨組織礦物鹽的含量和骨質量。在micro-CT結果中，BMD值可反應骨組織礦物鹽的含量。本研究結果顯示，Spermidine干預可提高老齡小鼠股骨BMD。骨質量的評價指標主要包括：Tb.BV/TV，Tb.N，Tb.Sp，Tb.Th，Ct.Th，Ps.Pm和Es.Pm等，其中Tb.Sp是預測老齡性骨折發生的關鍵指標，Tb.Sp增大與脆性骨折密切相關。本研究結果發現，Spermidine干預可降低老齡小鼠股骨的Tb.Sp，提高老齡小鼠股骨骨礦物鹽的含量。但Spermidine干預對反應皮質骨質量的指標Ct.Th，Ps.Pm和Es.Pm均無影響，這可能是由于皮質骨比松質骨的骨轉換率更低，對外界的刺激不敏感造成的。

綜上所述，本研究發現Spermidine能夠促進骨合成、緩解老齡小鼠的骨質疏松，因此提高老年人體內的Spermidine水平可能是治療老齡性骨質疏松癥的一種潛在治療手段。目前治療骨質疏松的雙膦酸鹽類和降鈣素類藥物主要是通過抑制骨分解發揮作用，對骨轉換率低的骨質疏松治療效果不佳。因此，通過促進骨合成發揮防治骨質疏松作用的藥物可能更具有市場前景，還將進行更深入地研究。