白三烯B4受體在尋常型銀屑病表皮中的表達

張 巍,涂曉娟, 楊祎娜, 舒 心

銀屑病是一種由免疫介導的慢性、復發性的常見皮膚炎性反應性疾病，尋常型銀屑病是最常見的類型。銀屑病常罹患終身，皮損為局限或廣泛分布的鱗屑性紅斑及斑塊，發作期伴有劇烈的瘙癢、灼熱等癥狀，藥物治療不能完全緩解，嚴重影響患者的生活質量和精神狀況。銀屑病的病因和發病機制復雜，至今尚未完全闡明。白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)來源于花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，是一種重要的炎性反應介質，BLT1和BLT2是目前已被鑒定的兩種LTB4受體。多項研究表明，LTB4參與了銀屑病的炎性反應和增殖過程。LTB4的炎性反應作用必須通過與特異性受體結合才能實現。本研究旨在通過免疫組織化學方法檢測BLT1和BLT2在尋常型銀屑病皮損表皮中的表達強度，探討白三烯B4受體(BLT1和BLT2)在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達情況，為尋找臨床治療新靶點提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2014-11-01至2018-10-31在我院皮膚科行常規組織病理檢查，并保存完整的尋常型銀屑病石蠟組織標本30例為銀屑病組。選取30例在整形外科行手術切除患者的正常皮膚為對照組。所有患者均于術前1個月無全身性用藥史，術前2周取材部位皮膚無局部用藥。排除標準：(1)妊娠期、哺乳期；(2)嚴重感染性疾病、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病；(3)惡性腫瘤、肝腎疾病及其他嚴重疾病者。銀屑病組男18例，女12例，平均(40.85±6.48)歲，病程6個月～18年。對照組男20例，女10例，平均(38.75±9.46)歲。兩組患者性別和年齡上差異無統計學意義(>0.05)，具有可比性。所有患者均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會批準通過。

1.2 主要試劑 兔抗人白三烯B4受體(BLT1和BLT2)多克隆抗體均為上海雅吉生物科技有限公司產品，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑均為北京中杉生物有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 石蠟組織標本 兩組皮膚組織均采用10%的甲醛溶液固定，后經脫水、透明、石蠟包埋等處理制作成石蠟組織標本，編號備用。

1.3.2 免疫組織化學法檢測 免疫組織化學染色采用鏈霉素-生物素過氧化物酶(S-P)三步法檢測BLT1和BLT2的表達。操作過程嚴格按照產品說明書進行。石蠟組織標本經修整后用切片機連續切片，厚度為5 μm，置于溫水中展開，采用聚賴氨酸處理過的載玻片撈片，置于65 ℃干燥箱中烤片2 h。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0.01 M枸椽酸鹽緩沖液(pH6.0)高壓鍋修復，3%HO孵育,滅活內源性過氧化物酶，正常山羊血清進行封閉，滴加兔抗人BLT1、BLT2多克隆抗體，濃度為1∶200，4 ℃冰箱過夜。滴加二抗(生物素化山羊抗兔抗體工作液)，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每次實驗均設陰性對照和陽性對照。BLT1和BLT2表達陽性表現為光鏡下胞漿出現淡黃色至棕黃色顆粒。陰性對照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，陽性對照為白三烯B4受體表達陽性的胰腺癌石蠟切片。

1.3.3 免疫組化BLT1和BLT2的光密度值分析 高倍顯微鏡下BLT1和BLT2表達陽性染色表現為棕黃色顆粒。采用Image-Pro Plus6.0軟件系統對免疫組化圖像進行半定量分析。按照隨機抽樣原則，在光學顯微鏡200倍視野下每張切分別攝取5個視野，測量每個視野陽性染色區域的平均光密度(AIOD)值，測量范圍是皮膚表皮基底層與角質層之間的區域，并求其平均值。以平均光密度值反映BLT1和BLT2的表達強度，平均光密度值越高，表達強度越大，反之亦然。全部圖片的采集及分析均由同一名操作人員完成。

2 結 果

2.1 免疫組化染色結果 BLT1和BLT2在銀屑病組和對照組皮膚組織中均有不同程度的表達，陽性著色部位主要是表皮角質形成細胞的胞漿，呈淡黃色至黃褐色顆粒，胞核未見明顯表達。(1)皮膚組織中BLT1的免疫組化染色結果：銀屑病組皮損組織表皮中，BLT1主要表達于棘層下部(圖1A)。對照組皮膚組織中，BLT1主要表達于基底層(圖1B)。(2)皮膚組織中BLT2的免疫組化染色結果：在銀屑病組皮損組織表皮中，BLT2在棘層中呈高表達，在基底層無表達或極少表達(圖1C)。對照組皮膚組織中，BLT2主要表達于基底層(圖1D)。

圖1 BLT1和BLT2在銀屑病皮損和正常皮膚表皮中的表達(SP，×400)A. BLT1在銀屑病皮損表皮棘層下部呈高表達；B.BLT1在正常人皮膚表皮基底層中表達為陽性；C.BLT2在銀屑病皮損表皮棘層中呈高表達；D.BLT2在正常人皮膚表皮基底層中表達為陽性

2.2 BLT1和BLT2表達強度比較 根據皮膚表皮組織中表達強度的平均光密度值統計分析結果顯示，與對照組平均光密度(128.29±6.16)相比，BLT1在銀屑病組平均光密度(144.82±17.75)顯著上調，差異有統計學意義(=2.838，=0.008)；BLT2在銀屑病組皮損中平均光密度(141.75±16.72)，明顯高于對照組(127.54±5.19)，差異有統計學意義(=2.604，=0.002)。

3 討 論

銀屑病是一種增殖過度性疾病，而這種增殖是由一系列復雜的炎性反應介質驅動的，主要與中性粒細胞、樹突狀細胞和Th17細胞介導的Th17免疫有關。表皮增生、中性粒細胞等炎性細胞浸潤、血管擴張是銀屑病的特征性組織學特征。中性粒細胞通常在角化不全病灶的正上方，中性粒細胞微膿腫通常在角質層的多個層次出現，通常位于角化不良小病灶的頂部，角化不全與中性粒細胞交替出現呈現“三明治征”。

LTB4是花生四烯酸在白細胞中經5-脂氧化酶代謝的活性產物之一，是重要的炎性反應介質，對白細胞(尤其是中性粒細胞)有強烈的趨化作用，可以使白細胞向炎性反應聚集，還可激活白細胞產生超氧產物，釋放炎性反應因子。有研究發現，LTB4可導致銀屑病早期皮損中大量中性粒細胞侵入表皮形成典型的微膿腫；LTB4還可抑制表皮細胞cAMP的生成，可能參與了銀屑病表皮角質形成細胞的過度增殖；銀屑病患者的皮損處LTB4濃度與銀屑病皮損面積與嚴重性指數(PASI)評分有顯著相關性。這些研究均表明，LTB4在銀屑病的發生和發展中發揮了重要的作用。因此，減少LTB4的生成、加快LTB4的清除、阻斷LTB4與其受體結合或可成為銀屑病治療的新靶點。

BLT1是LTB4特異性的高親和性受體，除粒細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞，還在1型輔助性T細胞(Th1)、2型輔助T細胞(Th2)、17型輔助T細胞(Th17)、效應CD8+T細胞、樹突狀細胞(DCs)和破骨細胞中表達。在咪喹莫特誘導的銀屑病模型中，中性粒細胞中的LTB4-BLT1信號通過與CXCL1/2趨化因子受體CXCR2協同作用，顯著加速了中性粒細胞在皮膚中的浸潤，并促進了銀屑病皮炎的發展。除了對中性粒細胞的影響外，LTB4還通過BLT1作用于皮膚樹突狀細胞和γδT細胞，促進其遷移和/或細胞因子的產生，這也促進了銀屑病皮炎的進展。BLT2是一種低親和性受體，但表達更為廣泛，這些受體通過介導LTB4的活性，參與宿主免疫應答和炎性反應疾病的發病機制。馬聰等通過外源性LTB4刺激小鼠體外誘導培養DCs，證明BLT2通路是LTB4介導的DCs趨化的關鍵通路，參與LTB4介導的 DCs TNF-α和IL-lβ的釋放。

本研究通過免疫組織化學的實驗方法檢測了BLT在銀屑病患者皮損處及正常人皮膚表皮組織中的表達情況，結果發現，BLT1和BLT2在銀屑病患者和正常對照皮膚表皮中均可見表皮角質形成細胞的胞漿，呈淡黃色至黃褐色顆粒，但BLT1和BLT2在表皮中的分布與正常皮膚不同，表達強度較正常對照皮膚明顯上調。這與文獻[15，16]的研究結果相似。在本實驗中，BLT1、BLT2在正常皮膚組織表皮中主要表達于基底層，提示二者在健康機體中參與重要的生理活動，維持正常的細胞周期。在尋常型銀屑病皮損組織表皮中BLT1和BLT2在棘層呈高表達，由此推測BLT1和BLT2可能參與了角質形成細胞異常增殖和分化、炎性反應細胞的趨化聚集。其中，BLT1主要表達于棘層下1/3，推測導致角質形成細胞的過度增殖及異常凋亡可能存在于棘層下部。由此本研究從病理學角度解釋了銀屑病皮損棘層全層角質形成細胞異常增殖及分化，但BLT1和BLT2在銀屑病棘層的表達分布模式值得進一步研究分析。

綜上所述，LTB4在尋常型銀屑病的發病機制中發揮著重要作用，在銀屑病皮損組織表皮中LTB4濃度升高，且皮損棘層中BLT1和BLT2高表達。LTB4通過其受體(BLT1和BLT2)發揮作用，誘導炎性反應細胞在皮損處聚集浸潤，參與角質形成細胞的異常增殖和分化，從而導致尋常型銀屑病皮損的產生。使用LTB4拮抗劑有望通過阻斷LTB4與受體結合從而減輕銀屑病炎性反應和表皮的過度增殖，這一治療方法有待進一步通過實驗來證實。