血清25-羥維生素D水平與慢性HBV感染的相關性研究

李波 朱慶峰 耿若琳 左維澤

25-羥維生素D3[25-hydroxyvitamin D3，25（OH）D3]與脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎（乙肝、丙肝）等肝病存在一定的相關性[1～4]，并與相關疾病導致的肝纖維化、肝硬化、肝癌及不良臨床結(jié)局相關[1]。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是世界性公共衛(wèi)生問題,全球目前約有2.57 億慢性乙型肝炎感染者，其中非洲地區(qū)和西太平洋地區(qū)占68%[5]。全世界每年約有88.7 萬人死于HBV 感染相關的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌[6]。根據(jù)2014年我國CDC 對1～29 歲人群乙型肝炎血清流行病學調(diào)查結(jié)果估計，目前我國乙肝表面抗原（HBsAg）陽性率為5%～6%，慢性HBV 感染者約7 000 萬例，雖然較前降低，但仍屬于中高流行地區(qū)[7]。但維生素D與HBV 感染不同階段的相關性還需進一步研究。HBV 感染的機制至今尚未完全闡明，其中免疫應答在HBV 感染過程中起重要作用[8]。本研究通過檢測慢性 HBV 感染患者血清25(OH)D3 水平，探討其與肝臟功能、纖維化程度、不同疾病階段的相關性,為慢性HBV 感染患者的疾病嚴重程度的評估提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料為降低自然環(huán)境因素（緯度、季節(jié)、日照時間）、遺傳因素（種族、膚色）、社會因素（飲食、生活習慣）的干擾，本研究納入2020年12月～2021年3月于石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院就診的石河子地區(qū)（北緯44.26 度，東經(jīng)86.09 度）漢族慢性HBV感染者，合計納入292 例，其中無癥狀HBV 攜帶者81 例，慢性乙型肝炎患者125 例，乙肝肝硬化代償期患者57 例，乙肝肝硬化失代償期患者29 例，其中男175 例，女117 例，年齡24～80 歲，中位年齡50 歲，作為觀察組；并選擇同期于我院體檢的健康體檢者按照年齡、性別進行1∶1 配對，作為對照組。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入與排除標準納入標準：觀察組研究對象診斷參考2019年版慢性乙型肝炎防治指南[2]。排除標準：①臨床資料不完整者；②合并其他嗜肝病毒感染所致的肝臟疾病者；③合并酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、代謝性肝病、肝細胞癌等肝臟疾病者；④伴有嚴重心、腦、肺、腎等疾病或嚴重糖尿病者；⑤入院前補鈣或維生素D 者；⑥惡性腫瘤及血液病者；⑦合并結(jié)締組織疾病或免疫系統(tǒng)功能障礙者；⑧伴代謝性疾病者，如甲狀旁腺功能亢進癥、甲狀旁腺功能減退癥。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準，參加者均知情同意。

1.3 檢測方法采集晨起空腹肘靜脈血，由醫(yī)院檢驗科專職技師完善血清25(OH)D3、肝功能、甲乙丙肝、HBsAg 定量、HBV DNA 等指標檢測，血清25(OH)D3檢測使用羅氏COBAS800 型電化學免疫分析儀及配套試劑，檢測范圍為7.50～175nmol/L；肝功能檢測使用美國貝克庫曼爾特AU5800 生化分析儀及配套試劑，丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）的正常值上限為40U/L，總膽紅素（TBIL）的正常值上限為17.1μmol/L，甲乙丙肝檢測使用蘇州新波檢測試劑盒，HBsAg 定量使用羅氏試劑（檢測范圍為0～52 000IU/mL）、HBV DNA 檢測使用湖南圣湘HBV 定量檢測試劑盒（檢測下限為100copies/ml），由影像科完成腹部彩超或肝臟CT 或肝臟MRI 等相關檢查，具體工作由專職檢驗技師、影像診斷醫(yī)師完成。對肝硬化患者進行 Child-Pugh 評分并分級，計算肝臟纖維化Fib-4 評分、ARPI 指數(shù)、S 指數(shù)等。將血清25(OH)D3 水平分為四級：≥75nmol/L為正常、50～75nmol/L 為不足、25～50nmol/L 為缺乏、≤25nmol/L 為嚴重缺乏[9，10]。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學處理,符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；組間兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗（Z 檢驗）；多組間比較采用方差分析；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson 進行相關性分析，P＜0.05 認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性HBV 感染患者與健康體檢者相關指標比較

病例組ALT、AST、TBIL、凝血酶原時間（PT）高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；白細胞計數(shù)（WBC）、血小板計數(shù)（PLT）、血紅蛋白（Hb）、白蛋白（ALB）、前白蛋白（PA）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、凝血酶原活動度（PTA）、25（OH）D3 低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組相關指標比較

2.2 不同疾病階段患者的血清25（OH）D3 水平比較對照組中血清25（OH）D3 缺乏者占55.82%（163/292）,病例組中缺乏者占87.67%（256/292）。無癥狀HBV 攜帶組血清25（OH）D3 水平（38.85±12.08）nmol/L低于對照組（51.41±14.14）nmol/L，P＜0.05）；乙肝肝硬化組（31.83±10.02）nmol/L 低于無癥狀HBV 攜帶組（38.85±12.08）nmol/L 和慢性乙型肝炎組（40.81±10.66）nmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在乙肝肝硬化組中，肝硬化失代償期組25（OH）D3 水平（26.44±11.23）nmol/L 低于肝硬化代償期組（34.57±8.15）nmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。無癥狀HBV 攜帶組低于慢性乙型肝炎組，但兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 血清25（OH）D3 水平與血清學、病毒學指標、纖維化指標相關性分析血清25（OH）D3 水平與ALB、PA、PTA、PLT、WBC、Lym 均呈正相關（P＜0.05），與PT、INR、Fib-4、S 指數(shù)均呈負相關（P＜0.05）。血清25（OH）D3 水平與HBV DNA 水平、HBsAg 定量、APRI 無相關性（P＞0.05）。見表2。

表2 血清25(OH)D3 水平與血清學、病毒學纖維化指標相關性分析

2.4 血清25（OH）D3 水平與Child-Pugh 評分的相關性乙肝肝硬化患者血清25（OH）D3 水平與Child-Pugh 評分呈負相關（r=-0.394，P＜0.05）。見圖1。在乙肝肝硬化Child-Pugh A 級患者中血清25（OH）D3 嚴重缺乏者占12.73%（7/55），Child-Pugh B 級患者中血清25（OH）D3 嚴重缺乏者占31.58%（6/19），Child-Pugh C 級患者中血清25（OH）D3 嚴重缺乏者占58.33%（7/12）。

圖1 血清25(OH)D3 水平與Child-Pugh 評分的相關性

3 討論

近年，隨著抗病毒藥物的使用以及乙肝疫苗的普及，人群HBsAg 流行率明顯降低，但因我國人口基數(shù)大，目前仍有約7 000 萬慢性HBV 感染患者。慢性HBV 感染易從慢性乙型肝炎發(fā)展到乙型肝炎肝硬化，甚至乙型肝炎相關原發(fā)性肝癌(HBVPLC)。HBV-PLC 是我國常見的惡性腫瘤之一，2020年我國新發(fā)原發(fā)性肝癌410 038 例（占全球45.3%）、病死391 152 例（占全球47.1%），其預后差，復發(fā)率及病死率高[11]。因此監(jiān)測慢性HBV 感染患者的疾病進展，成為此類人群預防肝癌發(fā)生的關鍵。

慢性HBV 感染的發(fā)病機制尚未完全明確，目前認為病毒引起的免疫應答是導致肝細胞損傷及炎癥壞死的主要機制；持續(xù)或反復出現(xiàn)炎癥壞死是慢性HBV 感染導致肝硬化、乙型肝炎相關原發(fā)性肝癌的重要因素[2]。維生素D 不僅具有維持體內(nèi)鈣和磷平衡的作用，還參與細胞的增殖、分化及凋亡，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學功能[12]。本研究主要分析了慢性HBV 感染患者不同疾病階段血清25(OH)D3 水平與肝臟功能、肝纖維化程度及病毒學指標的相關性。結(jié)果表明，維生素D 缺乏在慢性HBV 感染患者中普遍存在，特別是在肝硬化失代償期患者中更為顯著，血清25(OH)D3 水平與慢性HBV 患者肝臟損害程度呈負相關。本研究發(fā)現(xiàn)病例組患者25(OH)D3 缺乏者占87.67%，血清25(OH)D3 水平與ALB、PA、PLT、WBC、Lym、PTA 呈正相關（P＜0.05）。與Ko 等[3]研究結(jié)果類似，其納入的60 例肝病患者中，發(fā)現(xiàn)有88.3%的患者存在25(OH)D3 缺乏，可能是因為維生素D3 對處于免疫耐受期的慢性乙型肝炎患者有免疫調(diào)節(jié)和炎癥調(diào)節(jié)作用；在HBeAg 陰性的免疫耐受期患者中，維生素D3 水平與淋巴細胞亞群CD8、CD19 水平相關，可通過淋巴細胞亞群CD8、CD19和白細胞調(diào)節(jié)免疫功能，CD19 再通過調(diào)節(jié)B 細胞受體信號影響B(tài) 淋巴細胞的活化和分化，從而影響慢性HBV 感染的治療效果。一項動物實驗發(fā)現(xiàn)[13]，維生素D3 聯(lián)合干擾素治療小鼠乙肝與單用干擾素治療相比，CD4+細胞百分率和CD4+/CD8+明顯升高，CD8+細胞百分率下降，脾淋巴細胞增殖率較高，對乙肝小鼠療效較好，可能是維生素D3 提高了小鼠的免疫水平。天然維生素D 無生物活性，需要通過肝臟代謝后才能成為具有生物活性的維生素D。肝臟是25(OH)D3 的主要合成器官，維生素D 可能與慢性HBV 感染患者的免疫功能相關。在慢性HBV 感染患者中，肝臟功能減退導致活性維生素D生成減少，引起免疫水平降低，導致肝功能受損，可能使活性維生素D 的合成進一步減少，進而加重病情。Jamil 等[14]發(fā)現(xiàn)，維生素D 缺乏與終末期肝病評分模型、肝硬化Child-Pugh 分級顯著相關，其認為對于晚期肝硬化患者（Child-Pugh B 級和C 級）應定期監(jiān)測血清維生素D 水平，必要時可予以補充維生素D 及其相關類似物，以改善肝硬化患者的總體健康狀況。Child-Pugh 評分是臨床上用以評估肝臟儲備功能的標準之一，ALB、PA 是反映肝臟合成功能的臨床指標。本研究發(fā)現(xiàn)，血清25(OH)D3水平與Child-Pugh 評分呈負相關，與ALB、PA 呈正相關，提示血清25(OH)D3 水平與肝臟的功能相關，血清25(OH)D3 水平越低，提示肝臟功能越差。

Reiter 等[5]通過動物及細胞試驗發(fā)現(xiàn)維生素D及其類似物在體外和體內(nèi)均具有抗纖維化作用。Zhu 等[15]發(fā)現(xiàn)維生素D 缺乏可以通過增加Fas 和FasL，降低Bcl2 和Bclx，從而引發(fā)肝實質(zhì)細胞凋亡，并激活肝星狀細胞（Hepatic stellate cell，HSC）誘導肝纖維化。維生素D 可通過抑制肝星狀細胞活化及TGF-β/Smad 信號通路，負調(diào)控組氨酸富集鈣蛋白（Histidine enriched calcium protein，HRC），延緩肝纖維化[16]。血清25（OH）D3 水平與肝纖維化相關，其水平降低可加快肝纖維化進展。本研究發(fā)現(xiàn)血清25（OH）D3 水平與肝纖維化指數(shù)Fib-4、S 指數(shù)呈負相關，與ARPI 無明顯相關性，考慮可能與使用降酶藥物有關，且是基于評估慢性HCV 感染者相關肝纖維化程度的指標，用于評估HBV 相關肝纖維化程度的準確性較低有關[17]。本研究通過檢測慢性HBV 感染患者血清25（OH）D3 水平，發(fā)現(xiàn)隨著疾病嚴重程度的增加，血清25（OH）D3 水平逐漸降低。其中慢性HBV 感染患者各組血清25（OH）D3 水平均低于對照組，乙肝肝硬化患者血清25（OH）D3 水平低于無癥狀HBV 攜帶組和慢性乙型肝炎組，且肝硬化失代償期組低于代償期組，提示其可能與疾病進展相關。無癥狀HBV 攜帶組低于慢性乙型肝炎組，但兩組之間差異無統(tǒng)計學意義，血清25（OH）D3 水平與乙肝病毒學相關指標（HBV DNA 水平、HBsAg 定量）均無相關性，與既往Yu 等[18]報道一致，但與Ko 等[3]報道不一致。因此，血清25（OH）D3 水平與慢性HBV 感染患者病毒學指標的相關性還需更詳細和更大規(guī)模的研究來驗證。

綜上，慢性HBV 感染患者血清25(OH)D3 水平與肝臟功能、纖維化程度、不同疾病階段有一定的相關性；慢性HBV 感染患者血清25(OH)D3 缺乏廣泛存在，在肝硬化失代償期患者中尤為顯著；HBV感染患者肝臟損害越重，血清25(OH)D3 水平越低。建議臨床應密切監(jiān)測慢性HBV 感染患者的血清25(OH)D3 水平。