PTEN/mTOR通路在高糖誘導的人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo凋亡中的作用機制探討

彭青，溫彥靜，李茜，李曼，常美英

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝綜合征，作為妊娠期常見并發癥，其臨床發病率較高，占妊娠婦女的2%~8%，且在我國呈逐年上升趨勢，如果未得到及時診斷及治療則發生流產、胎兒畸形、并發子癇前期等不良妊娠結局的風險明顯增加［1］。體外實驗證實，人絨毛膜滋養層細胞侵襲力受損及螺旋動脈血管重構異常是子癇前期發展的基本特征［2］。研究顯示，高糖可誘導人絨毛膜滋養層細胞自噬并促進細胞凋亡［3］。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是一種抑癌基因，能夠誘導腫瘤細胞、人絨毛膜滋養層細胞等凋亡，抑制細胞侵襲［4］。賈真等［5］研究顯示，PTEN在子癇前期胎盤中過表達，其過表達可抑制滋養層細胞的侵襲和血管生成能力。邱瑞瑩等［6］研究發現，妊娠期糖代謝異常是子癇前期發病的危險因素，顯著增加子癇前期發生率。目前有關PTEN在高糖誘導的人絨毛膜滋養層細胞凋亡中作用機制的研究鮮有報道。本研究旨在探討PTEN在高糖誘導的人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo凋亡中的作用機制，以期為深入研究人絨毛膜滋養層細胞功能異常相關的病理性妊娠提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞 人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo（批號MCM-0599）購自寧波明舟生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 RPMI-1640培養基（批號NBG1236）購自美國Hyclone公司；胎牛血清（批號36G5782）購自美國Gibco公司；青霉素（批號FH673J）、二甲基亞砜（批號N6582J）、Lipofectamine 3000轉染試劑（批號SI70019）、四甲基偶氮唑藍（MTT，批號1120-02-1）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制劑（GDC-0349，批號T6510）均購自美國Sigma公司；PTEN-siRNA的陰性對照（批號SJ6009R）、PTEN-siRNA（批號SJ5002R）購自上海恒斐生物科技有限公司；胰蛋白酶（批號BD735N）、蛋白提取試劑盒（批號ME861R）、AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒（批號HUDY03）均購自上海碧云天生物技術有限公司；活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved caspase-3）抗體（批號XIN-56）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）抗體（批號XMN-68）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）抗體、PTEN抗體（批號BYCM-10005059）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）抗體（批號PL0402037）、磷酸化PI3K（p-PI3K）抗體（批號JCSW2521）、蛋白激酶B（AKT）抗體（批號FNab00273）、磷酸化AKT（p-AKT）抗體（批號F48643）、mTOR抗體（批號ATA33361）、磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體（批號IC194464）、GAPDH抗體（批號AL00167）、山羊抗兔二抗（批號674GN6）均購自美國Proteintech公司。CO2培養箱（型號NHD DYE1738）購自日本sanyo公司；Elx800酶標儀（型號HSG9832）購自美國Thermo公司；流式細胞儀（型號BeamCyte）購自常州必達科生物科技有限公司；凝膠成像系統（型號BioDoc-It220）購自美國UVP公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞株培養 人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo培養于含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養基中，放置于37℃飽和濕度、5%CO2及20%O2培養箱中，穩定傳代后收集對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2.2 細胞分組 取1.2.1對數生長期的人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo，重懸后接種于6孔板（1×106個/孔），待細胞融合度至80%時進行實驗。用含10%滅活胎牛血清的培養基培養24 h后分組。（1）空白對照組：僅加無血清培養基。（2）高糖組：加入濃度為50 mmol/L葡萄糖溶液［7］處理48 h。（3）NC組（陰性對照組）：加入濃度為50 mmol/L葡萄糖溶液處理48 h后，加入5μL Lipofectamine 3000和PTEN-siRNA的陰性對照。（4）PTEN-siRNA組（抑制PTEN表達組）：加入濃度為50 mmol/L葡萄糖溶液處理48 h后，轉染PTEN-siRNA序列。（5）GDC-0349組（mTOR通路抑制劑組）：加入濃度為50 mmol/L葡萄糖溶液處理48 h，轉染PTEN-siRNA序列后，加入50μmol/L GDC-0349溶液［8］。嚴格按照轉染試劑盒說明書進行操作，轉染后用無血清新鮮RPMI-1640培養基繼續培養24 h，收集各組細胞用于后續實驗。

1.2.3 MTT法檢測HTR-8/SVneo細胞增殖能力 取1.2.2各組培養48 h的人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo，經胰酶消化后接種至96孔板（5×104個/孔）繼續培養24 h，向各孔加入MTT（5 g/L）20μL，繼續培養4 h，棄去培養液，再分別加入150μL二甲基亞砜振蕩15 min，使藍紫色結晶充分溶解。在酶標儀中490 nm處測定各孔細胞光密度（OD），每組設置6個復孔，取平均值。計算細胞增殖抑制率（%）=（空白對照組OD-實驗組OD）/空白對照組OD×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取1.2.2各組培養48 h的人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo，PBS溶液洗滌2次，棄上清，并調節濃度至1×106個/mL的細胞懸液，取100μL細胞懸液加入5μL的AnnexinV/PITC及10μL質量濃度為20 mg/L的PI混勻，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測凋亡率。細胞凋亡率=（凋亡細胞數/總細胞數）×100%。每組重復6次。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白及PTEN/mTOR通路相關蛋白表達變化 取1.2.2各組培養48 h的人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo，每組重復6次，PBS洗滌2次，冰上加裂解液，裂解30 min，離心取上清，Lowry法進行蛋白定量。取50μg蛋白樣品進行電泳分離，電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上（95 mA電流）3 h。脫脂牛奶（5%）封閉3 h，加入cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、GAPDH抗體作為一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，次日加入山羊抗兔二抗（1∶5 000）及TBST，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL化學發光法顯色，采用Quantity One凝膠成像系統抓拍圖像并檢測各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與內參蛋白GAPDH灰度值比值作為蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 24.0軟件對數據進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組HTR-8/SVneo細胞增殖及凋亡情況比較 與空白對照組比較，高糖組HTR-8/SVneo細胞增殖抑制率及凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與高糖組、NC組比較，PTEN-siRNA組HTR-8/SVneo細胞增殖抑制率及凋亡率均顯著降低（P＜0.05）；與PTENsiRNA組比較，GDC-0349組HTR-8/SVneo細胞增殖抑制率及凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖1、表1。

2.2 各組HTR-8/SVneo細胞凋亡相關蛋白表達水平比較 與空白對照組比較，高糖組HTR-8/SVneo細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與高糖組、NC組比較，PTEN-siRNA組HTR-8/SVneo細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與PTEN-siRNA組比較，GDC-0349組HTR-8/SVneo細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖2、表2。

Fig.1 Flow cytometry of HTR-8/SVneo cell apoptosis in each group圖1 各組HTR-8/SVneo細胞凋亡流式圖

Tab.1 Comparison of the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HTR-8/SVneo cells between the five groups表1 各組HTR-8/SVneo細胞增殖抑制率及凋亡率的比較（n=6，%，±s）

Tab.1 Comparison of the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HTR-8/SVneo cells between the five groups表1 各組HTR-8/SVneo細胞增殖抑制率及凋亡率的比較（n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與高糖組比較，c與NC組比較，d與PTEN-siRNA組比較，P＜0.05；表2、3同。

組別空白對照組高糖組NC組PTEN-siRNA組GDC-0349組F細胞增殖抑制率0 29.32±5.82a 29.36±5.85a 12.56±2.92abc 21.53±3.58abcd 17.120＊＊凋亡率8.51±1.59 30.87±4.93a 30.00±4.95a 15.33±3.05abc 22.82±4.37abcd 34.671＊＊

2.3 各組HTR-8/SVneo細胞PTEN/mTOR通路蛋白表達水平比較 與空白對照組比較，高糖組HTR-8/SVneo細胞PTEN蛋白表達水平顯著升高，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR顯著降低（P＜0.05）；與高糖組、NC組比較，PTEN-siRNA組HTR-8/SVneo細胞PTEN蛋白表達水平顯著降低，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR顯著升高（P＜0.05）；與PTEN-siRNA組比較，GDC-0349組HTR-8/SVneo細胞PTEN蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR顯著降低（P＜0.05），見圖3、表3。

Fig.2 Western blot detection of HTR-8/SVneo cell apoptosis-related proteins in each group圖2 各組HTR-8/SVneo細胞凋亡相關蛋白印跡圖

Tab.2 Comparison of the expression levels of apoptosis-related proteins in HTR-8/SVneo cells between the five groups表2 各組HTR-8/SVneo細胞凋亡相關蛋白表達水平比較（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of apoptosis-related proteins in HTR-8/SVneo cells between the five groups表2 各組HTR-8/SVneo細胞凋亡相關蛋白表達水平比較（n=6，±s）

組別空白對照組高糖組NC組PTEN-siRNA組GDC-0349組F Bcl-2 1.17±0.18 0.36±0.05a 0.35±0.04a 0.87±0.09abc 0.55±0.06abcd 78.174＊＊Bax 0.19±0.04 1.25±0.18a 1.26±0.19a 0.63±0.13abc 0.97±0.15abcd 56.575＊＊cleaved caspase-3 0.23±0.04 1.18±0.18a 1.19±0.19a 0.61±0.11abc 0.87±0.13abcd 50.034＊＊

Fig.3 Western blot detection of PTEN/mTOR pathway-related proteins in HTR-8/SVneo cells圖3 各組HTR-8/SVneo細胞PTEN/mTOR通路蛋白印跡圖

Tab.3 Comparison of PTEN/mTOR pathway protein expression levels between five groups of HTR-8/SVneo cells表3各組HTR-8/SVneo細胞PTEN/mTOR通路蛋白表達水平比較 （n=6，±s）

Tab.3 Comparison of PTEN/mTOR pathway protein expression levels between five groups of HTR-8/SVneo cells表3各組HTR-8/SVneo細胞PTEN/mTOR通路蛋白表達水平比較 （n=6，±s）

組別空白對照組高糖組NC組PTEN-siRNA組GDC-0349組F PTEN 0.20±0.03 1.07±0.16a 1.08±0.16a 0.70±0.10abc 0.69±0.09abc 55.543＊＊p-PI3K/PI3K 1.06±0.16 0.25±0.03a 0.26±0.04a 0.87±0.13abc 0.52±0.09abcd 74.672＊＊p-AKT/AKT 1.13±0.17 0.32±0.05a 0.33±0.05a 0.90±0.14abc 0.60±0.09abcd 61.671＊＊p-mTOR/mTORimages/BZ_16_377_2680_379_2682.png1.26±0.18 0.27±0.04a 0.28±0.05a 0.97±0.15abc 0.59±0.09abcd 84.559＊＊

3 討論

3.1 高糖抑制人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo增殖 研究顯示，妊娠合并糖尿病患者胎兒生長受限、胎兒畸形及先兆子癇等發生率高達6%~10%［9］。人絨毛膜滋養層細胞來源于胚胎外胚層，具有類似腫瘤細胞的增殖、浸潤等生物學特性，能夠侵入母體蛻膜組織，為胚胎的發育提供充足的氧氣與營養［10］。目前有關高糖誘導的人絨毛膜滋養層細胞增殖抑制的機制尚未明晰。本研究通過采用含50 mmol/L葡萄糖RPMI-1640培養基模擬高糖環境，觀察高糖對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響，結果顯示，高糖可抑制人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo增殖。

3.2 高糖促進人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo凋亡 人絨毛膜滋養層細胞過度凋亡、細胞浸潤能力減弱是子癇前期、胎兒畸形等發生的原因之一［11］。韓云等［12］研究發現，妊娠糖尿病合并胎兒宮內生長受限可能與人絨毛膜滋養層細胞過度凋亡關系密切。Bcl-2是一種原癌基因，能抑制細胞凋亡［13］。Bax是人體最主要的促凋亡基因之一，當受到誘導凋亡刺激時，兩者結合在線粒體膜上形成異二聚體，使線粒體膜通透性增加［14］。caspase-3是凋亡途徑的關鍵因素［15］。本研究結果顯示，與空白對照組相比，高糖組HTR-8/SVneo細胞凋亡率升高，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平均顯著升高，且Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，與韓云等［12］研究結果一致，提示高糖可誘導人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo凋亡。

3.3 高糖通過PTEN/mTOR通路影響人絨毛膜滋養層細胞的增殖和凋亡 PTEN是一種雙重脂質磷酸酶，是一種抑癌因子。方曉珊等［16］研究顯示，子癇前期胎盤中PTEN高表達能夠加重母體內皮損傷以及胎盤滋養細胞損傷。且有研究證實，PTEN負向調控PI3K/AKT/mTOR信號通路［17］。PI3K是PI3K/AKT/mTOR信號通路的起始因子，其活化產生第二信使膜磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進一步磷酸化AKT蛋白的Thr308位點，促使AKT活化，而活化的AKT磷酸化并激活其下游靶蛋白mTOR，進而促進細胞生長，抑制細胞凋亡［18］。本研究結果顯示，下調PTEN表達后HTR-8/SVneo細胞增殖抑制率、凋亡率，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平均顯著降低，且Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達水平顯著升高，提示抑制PTEN表達可以促進人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo增殖，抑制其凋亡，可能與促進PI3K/AKT/mTOR信號通路活化有關。進一步研究發現，加入mTOR通路抑制劑可在一定程度上逆轉抑制PTEN表達對HTR-8/SVneo細胞增殖、凋亡的影響，進一步提示下調PTEN表達可能通過激活PI3K/AKT/mTOR通路發揮促HTR-8/SVneo細胞增殖的作用。

綜上所述，高糖可誘導人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo凋亡，可能與上調PTEN表達、抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路活化有關，可為人絨毛膜滋養層細胞功能異常相關的病理妊娠提供一定參考。本研究尚存在一定不足：首先，本研究未通過上、下游阻斷和過表達實驗驗證PTEN調控PI3K/AKT/mTOR信號通路對表型變化的影響；其次，僅測定了mTOR總蛋白的表達變化，未單獨檢測mTOR1和mTOR2的蛋白水平；另外，未能明確PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路在高糖誘導的HTR-8/SVneo細胞凋亡中的具體作用機制。后期仍需進一步研究。