血清中性粒細胞胞外誘捕網水平與狼瘡性腎炎的相關性

韓敬，顧津伊，劉裔，秦源，趙玲華

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）為系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）累及腎臟導致的繼發性免疫性腎小球疾病，是終末期腎病的常見病因，據統計我國近半數SLE患者患有LN［1-2］。隨著診療技術的不斷提高，SLE患者的預后有了明顯的改善［3］。我國SLE患者的平均發病年齡為30歲，50~60歲時超過一半患者死亡，其中LN居前期死因的前三位［4］。中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）是中性粒細胞釋放的包含中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、DNA等的網狀結構，是近年來發現的中性粒細胞防御機體感染的一種新方式，但NETs中也包含多種抗原，NETs生成增多或清除不及時可為自身抗原形成提供基礎，與自身免疫性疾病發生密切相關［5］。目前NETs與LN關系的研究較少，其臨床意義尚不清楚。本研究擬檢測LN患者血清NETs水平，分析其與LN病情以及預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2017年1月—2021年1月云南大學附屬醫院收治的LN患者為LN組，納入標準：（1）符合《中國狼瘡腎炎診斷和治療指南》診斷標準［6］。（2）腎活檢或臨床資料完整。（3）隨訪資料完整。排除標準：（1）合并類風濕性關節炎、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結腸炎等其他自身免疫性疾病。（2）合并急慢性感染、膿毒癥、惡性腫瘤。（3）近期接受免疫抑制劑或激素治療。最終納入LN患者92例，男21例，女71例，年齡22~51歲，平均（38.15±6.35）歲，病理分型［7］：Ⅱ+Ⅴ型28例，Ⅲ+Ⅴ型30例，Ⅳ+Ⅴ型34例。根據系統性紅斑狼瘡疾病活動度評分（SLEDAI）-2000評估疾病活動度［8］，將患者分為輕度活動組（評分≤6分，31例），中度活動組（評分7~12分，33例）和重度活動組（評分＞12分，28例）。另外，選擇同期收治的97例腎功能和尿常規正常的SLE患者為SLE組，SLE參照《系統性紅斑狼瘡診斷及治療指南》［9］診斷標準，男20例，女77例，年齡26~55歲，平均（38.69±6.42）歲。以83例門診體檢健康志愿者作對照組，男16例，女67例，年齡24~53歲，平均（38.15±6.39）歲。LN組、SLE組、對照組的性別（χ2=0.342）、年齡（F=0.189）比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準，受試者均知情同意并簽署同意書。

1.2 實驗室指標檢測 LN組和SLE組患者入院第2日晨、對照組體檢當日晨采集空腹靜脈血和24 h尿液，靜脈血標本3 mL置于干燥試管，取凝固后上層液離心（4℃，3 000 r/min，離心15 min，離心半徑10 cm），取血清保存于-20℃超低溫冰箱待檢。采用髓過氧化物酶（MPO）-DNA復合物捕獲酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測NETs水平，取血清樣本，96孔板每孔加入100μL（1∶50）稀釋的血清，加入抗MPO單克隆抗體（美國Bio-Rad公司），4℃孵育過夜；PBS洗滌3次，加入過氧化物酶底物（美國Bio-Rad公司），按照ELISA試劑盒（德國Roche公司）說明書檢測捕獲的MPO-DNA復合物，使用Mark微孔板吸光度分光光度計（美國Bio-Rad公司）檢測450 nm處的吸光度值。ELISA檢測血清脫氧核糖核酸酶1（DNASE1），取血清樣本，96孔板每孔加入100μL（1∶50）稀釋的血清，抗DNASE1兔多克隆抗體（英國Abcam公司），4℃下孵育過夜，PBS洗滌3次，加入100μL底物溶液并用50μL終止液封閉，使用Mark微孔板吸光度分光光度計（美國Bio-Rad公司）檢測450 nm處的吸光度值，ELISA試劑盒購自美國Bio-Rad公司。取血清樣本，采用美國愛德士Catalyst全自動生化分析儀檢測尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），采用改良MDRD公式估算腎小球濾過率（eGFR），eGFR=175×（Scr-1.234）×（年齡-0.179）×（0.79女性）［10］。采用鄰苯三酚紅比色法檢測24 h尿蛋白定量。

1.3 LN活動性指數（AI）和慢性指數（CI）評分 LN患者入院后當日評估腎組織AI和CI評分［11］。AI評分：從毛細血管內細胞增多（無增多計0分，增多＜25%計1分，增多25%~50%計2分，增多＞50%計3分）、中性粒細胞浸潤（無浸潤計0分，浸潤占比＜25%計1分，浸潤占比25%~50%計2分，浸潤占比＞50%計3分）、中性粒細胞核碎裂（無核碎裂計0分，核碎裂占比＜25%計1分，核碎裂占比25%~50%計2分，核碎裂占比＞50%計3分）、纖維素樣壞死（無壞死計0分，壞死占比＜25%計1分，壞死占比25%~50%計2分，壞死占比＞50%計3分）、內皮下沉積物（無沉積計0分，沉積占比＜25%計1分，沉積占比25%~50%計2分，沉積占比＞50%計3分）、細胞新月體（有細胞新月體計0分，細胞新月體占比＜25%計1分，細胞新月體占比25%~50%計2分，細胞新月體占比＞50%計3分）、纖維細胞新月體（有纖維細胞新月體計0分，纖維細胞新月體占比＜25%計1分，纖維細胞新月體占比25%~50%計2分，纖維細胞新月體占比＞50%計3分）、間質炎細胞浸潤（無炎細胞浸潤計0分，炎細胞浸潤占比＜25%計1分，炎細胞浸潤占比25%~50%計2分，炎細胞浸潤占比＞50%計3分）8項進行評分，總分0~24分。CI評分：從腎小球硬化（無硬化計0分，硬化占比＜25%計1分，硬化占比25%~50%計2分，硬化占比＞50%計3分）、纖維性新月體（無纖維性新月體計0分，纖維性新月體占比＜25%計1分，纖維性新月體占比25%~50%計2分，纖維性新月體占比＞50%計3分）、間質纖維化（無間質纖維化計0分，間質纖維化占比＜25%計1分，間質纖維化占比25%~50%計2分，間質纖維化占比＞50%計3分）、腎小管萎縮（無腎小管萎縮計0分，腎小管萎縮占比＜25%計1分，腎小管萎縮占比25%~50%計2分，腎小管萎縮占比＞50%計3分）4項進行評分，總分0~12分，得分越高，LN病情越嚴重。

1.4 隨訪 所有LN患者出院后接受定期電話隨訪（每月1次），隨訪截至2021年5月31日，記錄隨訪期間腎臟相關終點事件發生情況，包括Scr較基線翻倍、進入終末期腎臟病行腎臟替代治療［12］。根據隨訪期間腎臟相關終點事件發生情況將患者分為預后不良組（25例）和預后良好組（67例）。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據處理，經Kolmogorov-Smirnov法檢驗符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（組間多重比較LSD-t法）或獨立樣本t檢驗。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。Pearson法分析NETs與DNASE1、SLEDA1-2000評分、腎組織AI和CI評分、腎功能之間的相關性。Logistic逐步回歸分析影響LN預后的因素，受試者工作特征（ROC）曲線分析NETs對LN患者預后的預測價值。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組患者NETs、DNASE1及腎功能比較 LN組血清NETs水平、BUN、Scr、24 h尿蛋白定量高于對照組和SLE組，血清DNASE1水平、eGFR低于SLE組和對照組（P＜0.05）。SLE組血清NETs水平高于對照組，血清DNASE1水平低于對照組（P＜0.05），BUN、Scr、eGFR、24 h尿蛋白定量與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 不同疾病活動度LN患者血清NETs、DNASE1水平、腎功能、腎組織AI和CI評分比較 重度活動組血清NETs水平、BUN、Scr、24 h尿蛋白定量、AI評分、CI評分高于中度活動組和輕度活動組（P＜0.05），DNASE1水平、eGFR低于中度活動組和輕度活動組（P＜0.05）。中度活動組血清NETs水平、BUN、Scr、24 h尿蛋白定量、AI評分、CI評分高于輕度活動組（P＜0.05），DNASE1水平、eGFR低于輕度活動組（P＜0.05），見表2。

2.3 NETs與DNASE1、腎功能、SLEDA1-2000評分、腎組織AI和CI評分的相關性 NETs水平與eGFR（r=-0.536）、DNASE1（r=-0.765）呈 負 相 關（P＜0.05），與24 h尿蛋白定量（r=0.695）、SLEDA1-2000評分（r=0.764）、腎組織AI評分（r=0.859）、CI評分（r=0.878）呈正相關（P＜0.05）。

2.4 影響LN預后的因素分析 預后不良組SLEDA1-2000評分、AI評分、血清NETs水平、24 h尿蛋白定量高于預后良好組（P＜0.05），血清DNASE1水平、eGFR低于預后良好組（P＜0.05），見表3。以LN患者預后（0=預后良好，1=預后不良）為因變量，SLEDA1-2000評分、AI評分、NETs為自變量行多因素Logistic回歸分析，結果示高AI評分和高NETs為LN預后不良的危險因素（P＜0.05），見表4。

Tab.1 Comparison of clinical data between the three groups表1 各組臨床資料比較 （±s）

Tab.1 Comparison of clinical data between the three groups表1 各組臨床資料比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與SLE組比較，P＜0.05。

組別對照組SLE組LN組F n 83 97 92 NETs（μg/L）0.43±0.13 0.65±0.21a 1.02±0.30ab 176.741＊＊DNASE1（μg/L）4.32±1.35 3.75±0.84a 3.02±0.62ab 59.651＊＊BUN（mmol/L）6.12±1.47 6.53±1.62 38.15±9.15ab 995.797＊＊Scr（μmol/L）83.26±15.02 85.15±15.69 169.65±32.65ab 415.481＊＊eGFR［mL/（min·1.73 m2）］105.26±9.57 104.72±9.08 75.15±9.56ab 311.116＊＊24 h尿蛋白定量（g）0.05±0.01 0.06±0.02 2.65±0.72ab 940.744＊＊

Tab.2 Comparison of serum NETs,DNASE1 levels,renal function,renal tissue AI and CI scores between LN patients with different disease activity表2 不同疾病活動度LN患者血清NETs、DNASE1水平、腎功能、腎組織AI和CI評分比較 （±s）

Tab.2 Comparison of serum NETs,DNASE1 levels,renal function,renal tissue AI and CI scores between LN patients with different disease activity表2 不同疾病活動度LN患者血清NETs、DNASE1水平、腎功能、腎組織AI和CI評分比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與輕度活動組比較；b與中度活動組比較，P＜0.05。

組別輕度活動組中度活動組重度活動組F n 31 33 28 NETs（μg/L）0.81±0.09 1.02±0.25a 1.25±0.05ab 67.193＊＊DNASE1（μg/L）3.48±0.10 3.06±0.32a 2.46±0.05ab 196.048＊＊BUN（mmol/L）33.15±2.49 36.81±5.16a 45.26±2.03ab 106.179＊＊Scr（μmol/L）142.13±7.56 177.96±10.38a 190.32±6.15ab 254.911＊＊eGFR［mL/（min·1.73 m2）］82.16±2.03 75.35±4.04a 67.15±1.25ab 176.230＊＊24 h尿蛋白定量（g）2.09±0.08 2.78±0.32a 3.12±0.15ab 245.236＊＊AI評分（分）10.26±2.03 15.02±2.95a 19.35±3.28ab 91.757＊＊CI評分（分）5.26±1.09 7.15±1.52a 9.38±1.96ab 67.835＊＊

Tab.3 Comparison of clinical data between different prognostic groups表3 不同預后組臨床資料比較

Tab.4 Multivariate Logistic regression analysis of LN prognosis表4 影響LN預后的多因素Logistic回歸分析

2.5 NETs預測LN預后的價值分析 NETs預測LN患者預后的截斷值為1.06μg/L，曲線下面積（AUC）為0.871（0.785～0.932），敏感度為80.00%，特異度為86.57%，約登指數為0.666。見圖1。

Fig.1 ROC curve for NETs predicting LN prognosis圖1 NETs預測LN預后的ROC曲線

3 討論

LN是由SLE過程中產生的自身免疫性抗原-抗體復合物沉積在腎臟造成的損害所致。免疫功能障礙是LN發病的主要病理基礎，免疫系統在維持免疫應答和自身抗體免疫耐受平衡間發揮重要作用，免疫應答受損或過度免疫應答可導致T、B淋巴細胞活化失調，促使自身抗體產生，免疫復合物形成［13］。中性粒細胞是免疫系統中含量最豐富的細胞組分，在分化成熟后通過分泌細胞因子、吞噬、脫顆粒等方式殺滅病原菌，是機體固有免疫的重要組成部分。近年來研究發現中性粒細胞存在新的防御途徑，中性粒細胞在受到細菌、病毒、其他病原體感染刺激后可釋放出一種以DNA為框架的附著豐富顆粒蛋白和肽類物質的網狀纖維，可直接捕獲病原菌，這種結構被稱為NETs，其形成和排出細胞外的過程被稱為NETosis［14］。

NETs主要由胞質蛋白、解聚染色質和顆粒組成，釋放至胞外的NETs與彈性蛋白酶、防御素和活性氧共同形成防御網絡，捕獲和殺死入侵病原菌，具有宿主防御作用［15］。但是，NETs過度釋放或清除不及時可能給宿主帶來潛在損害，與自身免疫性疾病發病及其器官受損有關［16］。有研究顯示風濕性關節炎患者滑膜液中NETs含量增高，NETs網狀纖維結構附著大量風濕性關節炎瓜氨酸化抗原來源的肽酰基精氨酸脫亞胺酶2、4［17］。與健康人群相比，風濕性關節炎患者血清NETs含量明顯增高，NETs含量與抗瓜氨酸肽抗體呈正相關［18］。NETs與SLE亦存在密切關系，SLE患者降解NETs能力低于健康人群，NETs清除障礙可導致血清抗雙鏈DNA抗體增加和SLE癥狀加重［19］。NETs過度合成可上調基質金屬蛋白酶9表達，激活基質金屬蛋白酶2，誘導血管內皮細胞凋亡，參與SLE發病機制［20］。

本研究發現LN患者血清NETs水平明顯高于SLE組和對照組，NETs水平隨著疾病活動度增加而升高，相關性分析結果示NETs水平與24 h尿蛋白定量、腎組織AI、CI評分呈正相關，與eGFR呈負相關，說明NETs水平增加與SLE活動度增加、腎組織損傷以及腎功能下降密切相關。Bruschi等［21-22］也指出部分SLE患者降解NETs的功能受損，導致循環血中NETs增加和累積，與LN發病有關。分析原因為：NETs由DNA組成，NETs產生過程中釋放的活性氧可修飾DNA和蛋白質，使其具有免疫原性（指能引起免疫應答的性能），NETs是產生抗DNA自身抗體的主要來源，而抗DNA抗體是SLE特異性抗體之一，當NETs持續存在時可導致抗DNA抗體產生，免疫復合物形成并沉積于腎臟，促使腎小球腎炎發展［22］。Wang等［23］在SLE患者NETs中檢測到線粒體DNA（mtDNA），表明NETs是SLE患者抗DNA抗體的主要自身抗原來源，mtDNA/抗mtDNA抗體可通過Toll樣受體激活漿細胞樣樹突細胞和Ⅰ型干擾素，促使疾病活動增加和LN發生。DNASE1為降解NETs所必需，NETs在炎癥部位產生后隨即被DNASE1降解清除，DNASE1活性降低可導致NETs持續存在［24］，DNASE1缺陷可導致自身抗體產生，增加小鼠患SLE的風險，發生更嚴重的腎損傷［25］。本研究相關性分析結果也顯示，血清NETs水平與DNASE1呈負相關，提示DNASE1缺失可能介導了NETs清除障礙，增加NETs腎損傷作用。

本研究通過隨訪發現預后不良組血清NETs水平高于預后良好組，高NETs水平是LN腎臟相關終點事件發生的主要危險因素，說明NETs可作為LN預后評估的參考指標。ROC分析結果顯示NETs預測LN預后的AUC為0.871，敏感度和特異度達80.00%、86.57%，提示NETs具有一定的LN預后評估效能，可為臨床患者預后判斷提供參考。

綜上，SLE、LN患者血清NETs水平均升高；與SLE患者相比，LN患者血清NETs水平更高。NETs持續升高與SLE活動度增強、腎損傷和腎功能障礙有關，NETs可能參與SLE進展為LN的過程。高水平NETs是LN患者發生腎臟終點事件的危險因素，NETs可作為LN預后評估的潛在指標。