化瘀通絡中藥對糖尿病腎病大鼠氧化應激和炎癥的干預作用及其機制研究

李雅純， 方 敬， 郭 帥， 楊 帆， 陳志強,2*

(1.河北中醫學院，河北 石家莊 050091；2.河北省中醫院，河北 石家莊 050011)

國際糖尿病聯合會公布的數據顯示，2019年全球成人糖尿病患者超過4.63億，到2030年將增至5.78億。而糖尿病腎病是糖尿病的微血管并發癥，也是其最主要的慢性并發癥之一，影響著40%以上的糖尿病患者，在大多數國家已經成為導致終末期腎病的主要原因[1]。目前尚缺乏針對糖尿病腎病的特效藥物，而中醫藥對其防治有著巨大潛力。基于中醫病機理論結合多年臨床實踐，本課題組認為瘀血阻絡證貫穿糖尿病腎病病程始終，且此觀點已經成為業界的共識[2-5]。據證立法，化瘀通絡中藥因此成為臨床防治糖尿病腎病復方的必要組成部分。并且前期研究證實陳志強教授經驗方—益氣養陰消癥通絡方加減可明顯改善糖尿病腎病各期患者的臨床癥狀，降低血糖血脂并減少尿蛋白排泄[6-7]。為了明確具有不同功效的中藥治療靶點的差異性及其作用機制，選取陳志強教授臨床應用頻率最高的五味化瘀通絡中藥進行深入研究。

大量研究表明，高血糖誘導的氧化應激和炎癥在糖尿病腎病的進程中起著關鍵性的作用[8]，并且氧化應激與炎癥可以相互作用進行正反饋調節，從而加重腎臟損傷[9]。近年來核轉錄因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)信號通路在糖尿病腎病中的作用受到廣泛關注，動物實驗表明，Nrf2基因敲除可導致自身免疫性狼瘡性腎炎，并加重糖尿病引起的炎癥、氧化應激和腎損傷[10-11]。因此，Nrf2信號通路對于氧化應激和炎癥介導的腎損傷具有保護作用。故本研究以鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠為載體，探討化瘀通絡中藥對氧化應激和炎癥的干預作用及對腎臟Nrf2信號通路的影響，以期發現化瘀通絡中藥保護腎功能，改善腎損傷的可能作用靶點。

1 材料與方法

1.1 藥物 中藥配方顆粒，丹參(批號8080971)、川芎(批號8122561)、水蛭(批號8081351)、全蝎(批號8050111)、地龍(批號7125701)，均由廣東一方制藥有限公司惠贈；厄貝沙坦分散片(150 mg/片，華潤雙鶴利民藥業有限公司，批號1904238)。

1.2 動物 由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供SPF級雄性SD大鼠，體質量60～80 g，動物生產許可證號SCXK(京)2016-0006。

1.3 試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(瑞士Alexis公司，批號07171414)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號A003-1-2、A001-3-2)；大鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒(上海森雄科技實業有限公司，批號SXR063、SXR026)；凍存樣本核蛋白提取試劑盒(上海貝博生物科技有限公司，批號BB-3166)；小鼠單克隆抗體Nrf2(英國Abcam公司，批號ab89443)；小鼠單克隆抗體HO-1、小鼠單克隆抗體Keap1(美國Santa Cruz公司，批號sc-390991、sc-514914)；兔單克隆抗體Histone H3(Abways公司，批號CY6587)。

1.4 儀器 NanoDrop 2000C 紫外分光光度計(美國Thermo公司)；BX63+DP72正置研究級顯微鏡、IX71熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標儀(美國Molecular Devices公司)；紅外激光掃描儀(美國Odyssey公司)；全自動生化分析儀(日本Hitachi公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 模型建立和分組 40只大鼠普通飼料適應性喂養1周，檢測血糖和尿蛋白均為陰性。隨機選取7只作為正常對照組，予以普通飼料喂養。其余大鼠為造模組，用高糖高脂飼料喂養6周后，禁食不禁水12 h。以35 mg/kg給藥標準計算出每只大鼠所需STZ藥量，采用一次性腹腔注射法注射1% STZ溶液，72 h后3次尾靜脈取血檢測大鼠隨機血糖(random blood glucose，RBG)均≥16.7 mmol/L者即為糖尿病模型復制成功。2只大鼠不符合成模標準予以剔除，3只造模后死亡。隨后將成模大鼠隨機分為模型組10只、化瘀通絡中藥組9只和厄貝沙坦組9只。

1.5.2 給藥方法 化瘀通絡中藥由川芎、丹參、地龍、水蛭和全蝎組成。70 kg成人臨床一般常用配伍藥量為川芎12 g、丹參15 g、地龍10 g、水蛭6 g、全蝎6 g。根據此藥量，按照《中藥藥理研究方法學》換算出大鼠每天所需灌胃量，計算結果為川芎1.08 g/kg、丹參1.35 g/kg、地龍0.9 g/kg、水蛭0.54 g/kg、全蝎0.54 g/kg和厄貝沙坦13.5 mg/kg。正常組和模型組給予同容量純凈水灌胃。每天1次，連續灌胃16周。

1.5.3 24 h尿蛋白定量(24 h urine protein quantitation，24 h UTP)檢測 于16周末將大鼠置于代謝籠收集24 h總尿量，混勻后留取1 mL尿液離心取上清液，終點法檢測尿蛋白量。

1.5.4 血液指標檢測 10%水合氯醛300 mg/kg麻醉大鼠，剖腹，腹主動脈取血，全自動生化分析儀檢測腎功能；按照ELISA試劑盒說明書操作檢測血漿炎癥因子TNF-α和IL-1β水平；按照SOD和MDA試劑盒說明書操作檢測血漿SOD活性和MDA水平。

1.5.5 觀察腎臟病理變化 將腎組織在FAA固定液中充分固定24 h，流水沖洗12 h，按常規乙醇梯度脫水(70%、80%、90%、95%、100%)，二甲苯透明，浸蠟包埋。切片機切成約2 μm薄片，行HE和Masson染色，在光鏡下觀察，并使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件對Masson染色進行分析，計算出膠原面積占比。

1.5.6 免疫熒光檢測腎組織Nrf2核轉移 切片常規脫蠟至水，高壓修復，冷卻至室溫，自來水沖洗，加入3%雙氧水，PBS浸泡，并用5% BSA孵育30 min，滴加Nrf2一抗工作液(1∶100)，4 ℃過夜；PBS清洗后，滴加熒光二抗(1∶50)，37 ℃孵育；PBS清洗，滴加DAPI室溫孵育10 min，自來水沖洗，封片，熒光顯微鏡觀察。

1.5.7 Western blot法檢測Nrf2通路相關蛋白表達 提取腎皮質總蛋白(檢測Nrf2蛋白細胞核表達時使用核質分離試劑盒提取腎皮質的核蛋白)，BCA法檢測各樣品蛋白濃度并按比例稀釋，100 ℃水浴5 min。制膠，上樣，120 V電泳2 h，干轉30 min至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃分別孵育Nrf2(1∶1 000)、Keap1(1∶400)和HO-1(1∶400)過夜。洗膜后孵育相應的二抗1 h，ECL化學發光法顯影。目的蛋白相對表達量以目的條帶灰度值與β-actin或Histone H3灰度值的比值表示。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況及隨機血糖 正常對照組大鼠精神狀態良好，活動靈活，毛色有光澤；模型組大鼠精神萎靡，反應遲鈍，毛色晦暗無光，實驗過程中死亡3只；兩治療組大鼠一般情況較模型組有所改善，實驗過程中兩組大鼠各死亡2只。模型組及兩治療組RBG均較正常對照組升高(P<0.01)，但三組間大鼠RBG比較無明顯變化(P>0.05)。見表1。

2.2 24 h尿蛋白定量與腎功能 與正常對照組比較，模型組大鼠24 h UTP和血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平升高(P<0.01)；與模型組比較，化瘀通絡中藥組和厄貝沙坦組大鼠24 h UTP和Scr、BUN水平均降低(P<0.05，P<0.01)；兩治療組間比較無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血糖、24 h尿蛋白定量和腎功能比較

2.3 腎臟形態學觀察 正常對照組大鼠腎臟結構正常；模型組大鼠出現腎小球肥大，囊腔狹窄，部分腎小球甚至出現球囊粘連，并且腎小球基底膜(glomerular basemrnt membrane，GBM)明顯增厚，系膜細胞重度增生同時伴有細胞外基質(extracellular matrix，ECM)明顯增生；化瘀通絡中藥組和厄貝沙坦組大鼠腎臟病理得到明顯改善。Masson染色分析結果顯示，模型組較正常對照組膠原面積占比增加(P<0.01)；化瘀通絡中藥組和厄貝沙坦組較模型組膠原面積減少(P<0.01)，兩治療組間比較無明顯變化(P>0.05)。見圖1。

注：A為各組大鼠腎組織HE染色和Masson染色(×400)，B為各組大鼠腎組織膠原面積占比。與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，☆☆P<0.01。圖1 各組大鼠腎臟結構和膠原面積比較

2.4 氧化應激相關指標 與正常對照組比較，模型組大鼠MDA水平升高，SOD活性降低(P<0.01)；與模型組比較，化瘀通絡中藥組MDA水平降低(P<0.05)，厄貝沙坦組則無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，兩治療組SOD活性均升高(P<0.05，P<0.01)，且兩治療組間比較無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血漿SOD活性和MDA水平比較

2.5 炎癥因子水平 與正常對照組比較，模型組大鼠TNF-α和IL-1β水平升高(P<0.01)；與模型組比較，化瘀通絡中藥組TNF-α水平降低(P<0.05)，厄貝沙坦組則無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，化瘀通絡中藥組和厄貝沙坦組IL-1β水平均降低(P<0.05)，且兩治療組間比較無明顯變化(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血漿促炎因子水平比較

2.6 Nrf2信號通路相關蛋白表達 與正常對照組比較，模型組大鼠腎皮質Nrf2核轉移減少，Keap-1表達增加，HO-1表達降低(P<0.01)；與模型組比較，化瘀通絡中藥組Nrf2核轉移增加，Keap-1表達減少，HO-1表達升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，厄貝沙坦組Keap-1表達減少(P<0.01)，其余蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；與厄貝沙坦組比較，化瘀通絡中藥組Keap-1表達無明顯變化(P>0.05)。免疫熒光結果顯示，模型組較正常對照組Nrf2核轉移減少；化瘀通絡中藥組較模型組Nrf2核轉移增加；厄貝沙坦組與模型組比較Nrf2核轉移增加不明顯，與Western blot檢測結果基本一致。見圖2。

注：A為Western blot檢測各組大鼠腎皮質中核Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達，B為免疫熒光檢測各組大鼠腎皮質中Nrf2蛋白表達(×200)。與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，☆P<0.05，☆☆P<0.01。圖2 各組大鼠腎皮質中核Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達

3 討論

糖尿病腎病作為糖尿病嚴重的微血管并發癥，臨床表現以大量蛋白尿為主，病理表現以ECM過度堆積為其主要特征[12]。本研究中采用高糖高脂飼料聯合一次性小劑量注射STZ來復制糖尿病腎病大鼠模型，實驗結果顯示模型組大鼠較正常組血糖升高，腎功能受損，并出現大量蛋白尿，腎臟病理表現出GBM明顯增厚，ECM大量積聚，說明糖尿病腎病大鼠模型復制成功。給予化瘀通絡中藥治療后，糖尿病腎病大鼠Scr降低，尿蛋白減少，腎臟病理得到明顯改善，與本課題組前期研究一致[13]，表示化瘀通絡中藥可以改善糖尿病腎病的臨床癥狀，保護腎功能，延緩腎損害。

在糖尿病腎病的諸多發病機制中，氧化應激與炎癥起著關鍵作用。研究表明，由于ROS產生過多引起的腎臟氧化應激是導致ECM增生的主要原因之一[14]。并且氧化應激可以誘導炎癥因子的產生，細胞炎癥因子的增加又可以刺激自由基的產生，進一步加重機體氧化應激反應，從而建立一個惡性循環[15]。MDA為脂質過氧化的最終分解產物；SOD是對抗氧化應激的酶促防御系統的重要成分，對機體抗氧化反應起著至關重要的作用[16]。二者常被聯合檢測，用來反映氧化應激的程度。實驗結果顯示化瘀通絡中藥治療后的糖尿病腎病大鼠，較模型組MDA水平下降，SOD活性升高，提示在糖尿病腎病的進程中，化瘀通絡中藥具有抑制氧化應激的作用。研究表明炎癥因子TNF-α和IL-1β水平均與STZ誘導的糖尿病腎病大鼠的尿蛋白排泄有關[17-18]。因此，為了解糖尿病腎病大鼠體內的炎癥水平，本研究對血漿促炎因子TNF-α和IL-1β水平進行了檢測。本次實驗結果顯示化瘀通絡中藥組大鼠較模型組TNF-α和IL-1β水平降低，表明化瘀通絡中藥對炎癥反應具有抑制作用。

近年來，Nrf2信號通路在糖尿病腎病中的抗氧化和抗炎作用受到廣泛關注。STZ誘導的Nrf2基因敲除小鼠比野生型小鼠的氧化應激反應和腎損傷更嚴重[19]。且Nrf2敲除小鼠中促炎癥因子表達增加，炎癥反應較野生型小鼠更為強烈[20]。Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein，Keap1)被認為是Nrf2通路激活和抗氧化反應的一種抑制因子。正常狀態下，Keap1與Nrf2結合形成一個復合結構，使Nrf2錨定在細胞質中，并使其泛素化，不斷被降解。當機體發生氧化應激時，Nrf2-Keap1連接被打破，Nrf2被釋放進入細胞核內與下游靶基因啟動子的抗氧化應答元件(antioxidant response element，ARE)結合，中和自由基并加快細胞毒素清除[21]。血紅素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)是Nrf2重要的靶基因，它的啟動子序列包含兩個增強子區域(E1和E2)，Nrf2則通過E1和E2區域的ARE序列對HO-1蛋白表達進行調控。HO-1是一種限速酶，可以催化血紅素降解為一些具有抗氧化作用的副產物，如膽綠素、一氧化碳和Fe2+。研究表明這些副產物對受到氧化應激[22]和炎癥[23]刺激的細胞具有保護作用。本研究結果顯示，化瘀通絡中藥治療可以降低Keap1的表達，增加Nrf2核轉移，進而上調HO-1表達，表明Nrf2/HO-1信號通路可能是化瘀通絡中藥改善糖尿病腎病大鼠腎臟氧化應激與炎癥反應的靶點之一。

糖尿病在中醫歸屬于消渴的范疇，消渴的基本病機為氣陰兩虛，氣能行血，血無氣帥，則血行瘀滯；陰虛生內熱，熱灼津液，津血同源，津虧血少，脈道無以充養，則血行不暢，瘀滯更甚。因此，瘀血不僅作為一種病理產物，更是一個致病因素，引發糖尿病的一系列血管并發癥。而糖尿病腎病作為其中一個嚴重微血管并發癥，與瘀血的關系更為密切。葉天士指出“初為氣結在經，久則血傷入絡”。腎小球的毛細血管細長，回旋迂曲，與中醫所述絡脈特征類似。基于以上理論，本課題組提出瘀血阻絡是貫穿糖尿病腎病始終的主體病機，且此觀點已經成為業界的共識。因此，化瘀通絡中藥已經成為臨床治療糖尿病腎病的復方中一個必不可少的組成部分，且療效可靠[24]。根據臨床經驗[25]及前期基礎研究[26-27]，結合現代藥理研究[28-30]，本實驗選用草本藥物丹參、川芎與蟲類藥物地龍、水蛭、全蝎共奏活血化瘀，消癥通絡之功。

綜上所述，化瘀通絡中藥治療減少了糖尿病腎病大鼠的尿蛋白，其功效與厄貝沙坦相似。并且化瘀通絡中藥組大鼠Scr降低，腎臟病理得到明顯改善；MDA水平下降，SOD活性升高；炎癥因子TNF-α和IL-1β水平降低；Keap1表達減少，Nrf2核轉移增加，HO-1表達上調。由此可見，化瘀通絡中藥可以改善糖尿病腎病的氧化應激和炎癥反應，從而達到腎臟保護作用，而Nrf2/HO-1信號通路可能是其作用機制之一。