基于網(wǎng)絡藥理學和細胞實驗探討豆甾醇抗炎作用

吳力超， 李俊峰， 張婷婷， 陶方方， 劉文洪*

(1.浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學研究生院，浙江 杭州 310053)

炎癥是一種常見的病理生理過程，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，如阿爾茲海默癥[1]、動脈粥樣硬化[2]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[3]等。正常的炎癥反應有利于機體清除“異己”，過度炎癥反應可導致組織臟器功能障礙[4]。激素作為臨床控制炎癥的一線用藥[5]，長期使用容易導致腎上腺皮質(zhì)萎縮、無菌性股骨頭壞死和向心性肥胖[6]等并發(fā)癥。因此，開發(fā)具有低副作用的藥物已成為臨床迫切的需求。

研究表明，諸多中藥具有良好的抗炎功效。雷公藤在系統(tǒng)性紅斑狼瘡[7]、類風濕性關節(jié)炎[8]中應用較多。赤芍在慢性牙周炎中也體現(xiàn)出較好的抗炎作用[9]。由于中藥成分復雜，因此現(xiàn)代醫(yī)學對于中藥的研究多聚焦于中藥活性成分的探討。而豆甾醇作為雷公藤、赤芍等中藥的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒和抗腫瘤等多種生物活性[10-12]，已逐漸成為研究的熱點。

網(wǎng)絡藥理學融合了生物信息學和藥理學的方法，通過數(shù)據(jù)整合與計算分析，可系統(tǒng)性地闡明中藥及化合物與諸多疾病的相互關系，探究藥物作用機制[13]。因此，本研究擬采用網(wǎng)絡藥理學預測、細胞實驗驗證豆甾醇抗炎的作用靶點及可能機制，為抗炎藥物的研發(fā)及臨床應用提供一定理論支持。

1 材料

1.1 網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)庫 TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)；PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；SwissTargetPrediction網(wǎng)站(http://www.swisstargetprediction.ch/)；Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)；OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)；TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)；DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)；E Venn Diagram網(wǎng)站(http://www.ehbio.com/test/venn/)；STRING11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)；PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)。

1.2 細胞 小鼠RAW264.7細胞購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.3 試劑、藥物與儀器 豆甾醇(批號B20314，上海源葉生物科技有限公司)。高糖DMEM培養(yǎng)基(批號11965092)、胎牛血清(批號12483020)、青鏈霉素(批號10378016)購自美國Gibco公司；脂多糖(LPS，貨號L2880)、二甲基亞砜(DMSO，貨號D2650)購自美國Sigma公司；CCK8試劑盒(貨號BS350B)購自合肥白鯊生物科技有限公司；IL-10、IL-1β、TNF-α(貨號MM-0176M1、MM-0039M2、MM-0132M1)購自武漢酶免生物科技有限公司；TRIzol? Plus RNA Purification Kit、SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis SuperMix、PowerSYBR? Green PCR Master Mix(貨號12183-555、11752-050、4367659)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RIPA裂解液、SDS-PAGE膠試劑盒、脫脂奶粉、BCA蛋白試劑盒、彩色預染蛋白marker(貨號P0013B、P0012A、P0216、P0012、P0075)購自上海碧云天生物技術有限公司；MAPK3兔單克隆抗體、PRKACA兔單克隆抗體、β-actin兔單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(貨號ab32537、ab32390、ab8226、ab6721)購自英國Abcam公司。CFX384多重實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像儀購自上海勤翔科學儀器有限公司。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡藥理學方法

2.1.1 豆甾醇理化參數(shù)及潛在靶點獲取 利用豆甾醇(stigmasterol)的CAS號83-48-7，從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取該化合物的特征信息及理化參數(shù)，并獲取相應靶點；PubChem數(shù)據(jù)庫獲得豆甾醇的SDF文件，將SDF文件導入SwissTargetPrediction網(wǎng)站，進行靶點預測，獲取豆甾醇的潛在靶點。2個數(shù)據(jù)庫結果取并集。

2.1.2 炎癥相關靶點收集 以“inflammation”為關鍵詞輸入到Genecards數(shù)據(jù)庫，通過限定中位數(shù)，選取Relevance score>2.96的靶點；輸入OMIM、TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫，檢索獲得已驗證的炎癥相關靶點，4個數(shù)據(jù)庫結果取并集。

2.1.3 藥物與疾病共同靶點篩選及互作網(wǎng)絡構建 使用Venn圖在線網(wǎng)站對炎癥靶點和豆甾醇靶點取交集，獲取藥物與疾病的共同靶點，繪制Venn圖，交集基因即代表豆甾醇治療炎癥的潛在作用靶點。利用STRING11.0數(shù)據(jù)庫構建共同靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡，下載tsv文件，導入Cytoscape軟件進行可視化。

2.1.4 核心靶點篩選 利用Cytoscape軟件中的“Network Analyzer”插件分析PPI網(wǎng)絡中各個靶點的Degree值，按照Degree值的大小排序，篩選出核心靶點(Degree值越大，說明網(wǎng)絡中該靶點的重要性越強，篩選標準為大于Degree值中位數(shù)的2倍[14])。

2.1.5 GO和KEGG富集分析 利用R軟件中的“clusterProfiler”包[15]對篩選出的核心靶點進行分析，包括基因本體(gene ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路分析，以P<0.05為標準，篩選出靶點參與的GO富集項目及KEGG通路信息。并用R軟件對上述結果進行可視化分析。

2.1.6 分子對接 從PDB數(shù)據(jù)庫獲取MAPK3(ID:4QTB)和PRKACA(ID:4WB8)的pdb格式文件，使用Autodock對兩個蛋白進行去水、加氫處理。在TCMSP數(shù)據(jù)庫下載豆甾醇的mol2格式文件，利用Autodock Vina進行對接，計算結合能。使用Pymol2.4.2進行結果的可視化操作。

For the Figure 1a), the relationship of configuration formula derivation is shown as:

2.2 細胞實驗方法

2.2.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于對數(shù)期進行傳代備用。

2.2.2 CCK-8檢測細胞存活率 取對數(shù)期細胞(1×104個/孔)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，實驗組加入含藥培養(yǎng)液(質(zhì)量濃度分別為1 000、500、250、125、62.5 μg/mL)；對照組加入等量0.5% DMSO；并設置不含細胞的空白組，每組設5個復孔。培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑，于37 ℃孵育4 h。于450 nm處，使用酶標儀測定光密度(OD)值。根據(jù)公式計算細胞存活率，摸索藥物的最大無毒濃度(細胞存活80%以上)。細胞存活率=[(OD實驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%

2.2.3 細胞分組及干預 取對數(shù)生長期細胞，按照2×105/mL密度進行鋪板，分為正常組、模型組、給藥組(250、125、62.5 μg/mL)。除正常組外均用脂多糖(LPS)構建炎癥模型，給藥組預先加入不同質(zhì)量濃度的豆甾醇干預1 h后，再加入LPS(1 μg/mL)。

2.2.4 ELISA檢測細胞IL-10、IL-1β、TNF-α水平 細胞按照“2.2.3”項下分組方法進行分組，給藥干預24 h，取細胞培養(yǎng)上清液，離心后按照ELISA試劑盒說明書操作進行檢測。

2.2.5 RT-qPCR檢測細胞中MAPK3、PRKACAmRNA的表達 細胞按照“2.2.3”項下分組方法進行分組，給藥干預24 h，棄去培養(yǎng)上清，PBS清洗2次。用Trizol試劑提取細胞總RNA，在試劑盒說明書操作下，將RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA(25 ℃，10 min；50 ℃，30 min；85 ℃，5 min)，并進行RT-qPCR分析(95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；63 ℃，25 s；72 ℃，15 s；擴增40個循環(huán))。使用β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△CT法進行分析。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司負責合成，引物序列見表1：

表1 引物序列

2.2.6 Western blot檢測RAW264.7細胞中部分關鍵靶點蛋白的表達 細胞按照“2.2.3”項下分組進行給藥，給藥24 h后，棄去細胞上清液，每孔加RIPA細胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)100 μL，冰上充分裂解45 min，4 ℃、12 000×g離心15 min，棄去沉淀，收集上清液，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，10% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜120 min。轉(zhuǎn)膜結束后，TBST漂洗3次，每次5 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗MAPK3(1∶1 000)、PRKACA(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。棄去一抗后，TBST漂洗3次，每次5 min，加入二抗(1∶1 000)，室溫25 ℃孵育2 h。最后ECL化學發(fā)光顯影，采集圖像并使用Image J分析灰度值。

3 結果

3.1 豆甾醇的理化性質(zhì) 從TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取豆甾醇的理化性質(zhì)及藥理分子性質(zhì)數(shù)據(jù)，類藥性(drug likeness, DL)可以用于評估一種成分開發(fā)成藥物的可能性，口服利用度(oral bioavailability, OB)則用于評價成分吸收進入血液發(fā)揮作用的難易程度。結果顯示，OB≥30%，DL≥0.18，表明豆甾醇吸收度好，開發(fā)成藥物的可能性較高(表2)。

表2 豆甾醇藥理分子性質(zhì)

圖1 豆甾醇目標靶點

3.3 共同靶點獲取及PPI網(wǎng)絡構建 Venn圖結果表明，通過匹配129個藥物靶點和2 945個疾病靶點，篩選出88個共同靶點(圖2A)，這88個共同靶點是豆甾醇抗炎的潛在靶點。將88個靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡，PPI網(wǎng)絡中有88個靶點(Node)和373條邊(Edge)。“Network Analyzer”插件可以用于分析靶點的貢獻度(Degree)值，利用分析后的拓撲參數(shù)結果來對PPI網(wǎng)絡進行可視化，形狀越大，顏色越深，表明該節(jié)點的Degree值越大(圖2B)。

圖2 豆甾醇抗炎的潛在靶點Venn圖(A)和蛋白互作網(wǎng)絡圖(B)

3.4 核心靶點分析結果 將“3.2”項中分析得到的Degree值導出后進行分析，Degree值中位數(shù)的2倍即14作為拓撲指標篩選核心靶點，分析后得到15個核心靶點，如MAPK3、PTGS2和PRKACA等(圖3)。

圖3 網(wǎng)絡分析核心靶點

3.5 GO/KEGG富集分析結果 將上述15個核心靶點導入R軟件，使用R軟件中“clusterProfiler”包對核心靶點進行富集分析，將15個靶點的基因名轉(zhuǎn)換為Entrez ID(表3)，進行后續(xù)富集分析。

表3 基因名及對應的Entrez ID

GO富集分析結果顯示，具有生物學過程(biological process, BP)695條，細胞成分(cellular component, CC)13條，分子功能(molecular function, MF)46條，根據(jù)GeneRatio值大小各篩選出前10條展示。由圖4可知，BP主要涉及對類固醇激素的反應(response to steroid hormone)、對營養(yǎng)水平的反應(response to nutrient levels)、生殖系統(tǒng)發(fā)育(reproductive system development)等；CC主要涉及膜筏(membrane raft)、核斑點(nuclear speck)等；MF主要涉及核受體活性(nuclear receptor activity)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、酰胺結合(peptide binding)等。

KEGG通路分析結果表明，豆甾醇治療炎癥的靶點主要富集在39條信號通路上(P<0.05)。根據(jù)GeneRatio值大小篩選出前20條KEGG通路，并利用R軟件繪制氣泡圖(圖5)。主要涉及雌激素(estrogen signaling pathway)、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、甲狀腺激素等信號通路(thyroid hormone signaling pathway)，表明豆甾醇可能通過雌激素、內(nèi)分泌抵抗和甲狀腺激素等信號通路發(fā)揮抗炎作用。KEGG結果顯示雌激素信號通路GeneRatio值最高，富集靶點最多，說明該信號通路與豆甾醇抗炎作用較為密切，因此后續(xù)實驗選擇雌激素信號通路進行驗證探討。

圖4 GO富集分析結果柱狀圖(前10)

圖5 KEGG分析結果氣泡圖(前20)

3.6 分子對接結果 5個核心靶點中，Degree值前二的兩個靶點為MAPK3與PRKACA，分別為36與18。使用Autodock Vina軟件對豆甾醇及MAPK3與PRKACA蛋白進行對接，獲得結合能。結果顯示豆甾醇與MAPK3的結合能為-7.4 kcal/mol，與PRKACA的結合能為-7.5 kcal/mol。Pymol可視化結果發(fā)現(xiàn)，豆甾醇與MAPK3的ARG-96殘基相連(圖6A)，與PRKACA的SER-259殘基相連接(圖6B)。

圖6 分子對接結構圖

3.7 豆甾醇對RAW264.7細胞活力的影響 不同質(zhì)量濃度豆甾醇作用RAW264.7細胞24 h后，隨著質(zhì)量濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，當給藥質(zhì)量濃度為250 μg/mL時，細胞存活率達到80%以上。因此，選擇250 μg/mL為最大給藥濃度(圖7)。

圖7 不同質(zhì)量濃度的豆甾醇對細胞活力的影響

3.8 豆甾醇對RAW264.7細胞中細胞因子IL-10、IL-1β和TNF-α水平的影響 與正常組比較，模型組細胞中的IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.05)；與模型組比較，豆甾醇給藥組中IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05，P<0.01)(圖8A～8B)，IL-10水平升高(P<0.05，P<0.01)(圖8C)。藥物干預后，2種細胞因子的變化均呈現(xiàn)劑量依賴性關系。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖8 RAW264.7細胞中IL-1β、TNF-α和IL-10的水平

3.9 豆甾醇對RAW264.7細胞中MAPK3、PRKACAmRNA表達的影響 與正常組比較，模型組細胞中MAPK3 mRNA表達升高(P<0.01)，PRKACAmRNA表達降低(P<0.05)；與模型組比較，62.5、125、250 μg/mL豆甾醇組細胞中MAPK3表達降低(P<0.05，P<0.01)，250 μg/mL豆甾醇組PRKACA表達升高(P<0.01)(圖9)。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖9 RAW264.7細胞中PRKACA和MAPK3 mRNA表達

3.10 豆甾醇對RAW264.7細胞中MAPK3、PRKACA蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組細胞中MAPK3蛋白表達增加(P<0.05)，PRKACA蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組比較，125、250 μg/mL豆甾醇組細胞中MAPK3蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，62.5 μg/mL豆甾醇組無明顯變化(P>0.05)，250 μg/mL豆甾醇組PRKACA表達升高(P<0.01)，62.5、125 μg/mL豆甾醇組PRKACA表達無明顯變化(P>0.05)。蛋白表達與mRNA表達基本一致，表明豆甾醇可能通過下調(diào)MAPK3和上調(diào)PRKACA的表達，改善LPS誘導的炎癥模型(圖10)。

4 討論

慢性持久的炎癥反應可能會導致多種疾病，如腫瘤[16]、多器官功能障礙綜合征[17]。據(jù)報道，重癥新冠肺炎患者體內(nèi)，炎癥細胞因子水平IL-1β、TNF-α、CSF等增加，造成機體自身的免疫攻擊，易引起患者死亡[18]。因此，控制過度的炎癥反應對于機體的功能恢復至關重要。網(wǎng)絡藥理學通過數(shù)據(jù)庫整合挖掘，結合實驗驗證能有效發(fā)現(xiàn)藥物-疾病之間的新聯(lián)系。

首先利用TCMSP數(shù)據(jù)庫來獲取豆甾醇的理化參數(shù)，評估藥物的理化參數(shù)對于后續(xù)的分析至關重要。OB≥30%，DL≥0.18被廣泛應用于篩選藥物活性成分[19]。豆甾醇的理化參數(shù)表明其具有開發(fā)成有效藥物的潛力；Venn圖表明豆甾醇可能通過88個靶點作用于炎癥。核心靶點的挖掘可以獲取共同靶點中更為重要的靶點。Cytoscape發(fā)現(xiàn)88個靶點中，核心靶點包括MAPK3、PPARG和PRKACA等15個靶點。

KEGG分析顯示雌激素信號通路與豆甾醇關系較為密切，同時該通路富集了5個核心靶點，包括MAPK3、PRKACA、PGR等。研究發(fā)現(xiàn)，補骨素能通過抑制雌激素信號通上的PGR、CTSD基因表達，降低炎癥因子水平[20]。染料木素可以通過上調(diào)PRKACA的表達，降低血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應[21]。氧化白藜蘆醇可以抑制ERK1/2信號通路上的MAPK3來發(fā)揮抗炎作用[22]。因此，推測豆甾醇也可能通過干預雌激素信號通路發(fā)揮抗炎作用。分子對接顯示，豆甾醇與MAPK3、PRKACA的對接結合能均較低。文獻表明[23]，結合能小于-5 kcal/mol認為結合效果較好。結合能越低，表明配體與受體之間的相互結合力越強。分子對接表明豆甾醇能與MAPK3、PRKACA的活性基團以氫鍵相結合，從而抑制目標蛋白的活性。

當巨噬細胞受到LPS刺激后，會產(chǎn)生大量炎癥因子，包括IL-1β、TNF-α、IL-6等，而IL-10作為淋巴細胞分泌的抗炎因子，可以抑制炎癥因子分泌，減輕炎癥反應[24]。ELISA結果顯示，豆甾醇能有效抑制炎癥模型中炎癥因子IL-1β和TNF-α的水平，并且升高抗炎因子IL-10水平，初步表明豆甾醇具有抗炎功效，與先前研究一致[25]。在RT-qPCR與Western blot實驗中，LPS作用于RAW264.7細胞后，MAPK3表達升高，PRKACA表達降低；經(jīng)過豆甾醇干預后，MAPK3表達降低，PRKACA表達升高。MAPK3參與細胞的增殖、分化與凋亡，經(jīng)過LPS刺激后，MAPK3激活下游細胞因子參與炎癥反應[26]。PRKACA是第二信使cAMP下游分子，活化的cAMP/PRKACA通路可以抑制炎癥反應[27]。因此，豆甾醇可能通過調(diào)節(jié)雌激素信號通路上MAPK3和PRKACA兩個核心靶點的表達，調(diào)控細胞因子水平，從而發(fā)揮抗炎作用。該實驗結果進一步證實了網(wǎng)絡藥理學預測的準確性和可靠性。