基于網絡藥理學探究敦煌平胃丸對SGC-7901細胞的抑制作用

董娟娟， 李亞玲,， 劉東玲， 李俊杰， 李高勤， 舍雅莉， 劉永琦,,4*

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫藥大學中西醫結合學院，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅中醫藥大學，敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

胃癌是發病率和死亡率分別位居全球第五位和第三位的惡性腫瘤，2015版美國國家綜合癌癥網絡(NCCN)指南顯示目前胃癌的治療仍以手術結合化療為主。近年來，基于天然藥物的抗腫瘤藥物是制藥研發的熱點。敦煌平胃丸出自敦煌古書《不知名氏辨脈法》，方中大黃為君藥，附子、干姜、藁本、苦參、桔梗、防風、土鱉蟲合而為臣藥，當歸、人參、玄參同為佐使，該方在臨床已用于治療胃癌及其癌前病變，付航等[1]動物實驗證明其治療胃癌與干預Notch信號通路有關，但其具體機制仍不明確。故本研究擬采用胃癌荷瘤裸鼠模型和網絡藥理學，初步探討敦煌平胃丸防治胃癌的療效及發揮作用的潛在活性分子、靶點和通路，為新的胃癌藥物的研發提供理論分析和實驗基礎。

1 材料

1.1 動物與細胞株 BALB/c裸鼠，SPF級，雌雄各半，體質量18～22 g，共40只，購自甘肅中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號SCXK(甘)2015-0002。人胃癌細胞株SGC-7901，購自北京北納創聯生物技術研究院。

1.2 試劑、藥物與儀器 敦煌平胃丸由大黃、苦參、干姜、藁本、附子、防風、桔梗、土鱉蟲、人參、玄參、當歸組成，由甘肅中醫藥大學附屬醫院提供。順鉑(合肥巴斯夫生物科技有限公司，批號BSF190225，規格50 mg/支)。1640培養液(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號AE29247265)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號19100504)；FITC偶聯Annexin-V凋亡檢測試劑盒(美國BD公司，批號9312842)。FACSCelesta流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 軟件及數據庫 TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；TCMID數據庫(http://www.megabionet.org/tcmid/)；BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)；TTD數據庫(http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)；HPO數據庫(https://hpo.jax.org/app/)；OMIM數據庫(https://www.omim.org/)；Drugbank數據庫(https://www.drugbank.ca/，version5.1.1)；Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；String數據庫(https://string-db.org/，version 10.5)；Uniport數據庫(https://www.uniprot.org/)；DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)；OmicShare tool平臺 (www.omicshare.com/tools)；cytoscape(version3.7.2)。

2 方法

2.1 動物實驗

2.1.1 中藥制備 將組方藥材飲片用蒸餾水浸泡30 min后，第1次加8倍量水煎煮1.5 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并煎液，水浴鍋濃縮至100 mL，生藥量為6 g/mL，置于在4 ℃中冰箱備用。

2.1.2 細胞培養及模型建立 人SGC-7901胃癌細胞培養在含10%胎牛血清的1640培養液中，細胞懸浮液密度為1×107/mL，裸鼠腋下注射0.2 mL/只。給藥7 d后，選取瘤體直徑大于5 mm的24只裸鼠進行下一步實驗。

2.1.3 分組與給藥 將造模成功的裸鼠隨機分為對照組、順鉑組、敦煌平胃丸組，每組8只，對照組裸鼠灌胃給予0.9%NaCl溶液0.1 mL；順鉑組裸鼠腹腔注射順鉑(20 mg/kg)0.1 mL，敦煌平胃丸組裸鼠灌胃給予藥物水煎液30 g/kg，每天1次，連續10 d。所有用藥劑量依據人與動物間體表面積折算的等效比值計算所得。

2.1.4 指標檢測 第11天裸鼠眼球取血后處死，剝離瘤體，測定瘤體體積V，計算抑瘤率，公式為抑瘤率=(1-V實驗組/V對照組)×100%。取一部分瘤體，4%多聚甲醛液固定后石蠟包埋，進行切片和HE染色，在倒置顯微鏡下觀察腫瘤組織和細胞形態。

取部分新鮮移植瘤組織標本至無菌培養皿中，制備瘤體細胞懸液，洗滌2次后在細胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液重懸細胞，使細胞密度達到1×106/mL，吸取100 μL至新管中，加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，室溫避光孵育后采用流式細胞儀檢測凋亡情況。

2.2 網絡藥理學研究

2.2.1 有效成分篩選 采用TCMSP、TCMID數據庫，依次輸入11種組方藥材，獲得全方成分，剔除重復后依據毒藥物動力學(ADME)特性，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為標準篩選有效成分，cytoscape軟件構建“藥物-有效成分”網絡。

2.2.2 有效成分作用靶點及胃癌疾病靶點篩選 采用TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM數據庫，輸入“2.2.1”項下有效成分，得到對應成分靶點。CNKI、萬方、NCBI數據庫，以“胃癌”為搜索詞獲得文獻來源的靶點,TTD、HPO、OMIM數據庫獲得數據庫來源的靶點，去除重復后整合得到疾病靶點。

2.2.3 可視化網絡構建 篩選成分靶點和疾病靶點中的共同靶點，構建“成分靶點-疾病靶點”網絡圖。采用String數據庫，輸入上述所得到的成分靶點和疾病靶點，設定交互置信區間>0.9，獲得靶點相互作用網絡，并將其導入cytoscape。采用Network Analyzer分析網絡的拓撲性質，以節點的度數(degree)、介數(betweenness centrality)、緊密度(closeness centrality)為條件，篩選互作網絡中重要靶點。采用cytoscape軟件中的Mcode插件，以K-Core=2為標準對“成分靶點-疾病靶點”進行分子功能模塊聚類分析，得到每個模塊的種子靶點。將上述3種方法得到的重要靶點去重后合并，得到“成分靶點-疾病靶點”相互作用網絡中的關鍵靶點，并進行可視化分析。

2.2.4 “藥物-關鍵成分-關鍵靶點”網絡建立 采用TCMSP、TCMID數據庫，獲得“2.2.3”項下關鍵靶點(Uniport數據庫對名稱進行轉換)、對應的關鍵活性成分及活性成分歸屬藥物，采用cytoscape軟件建立“藥物-關鍵成分-關鍵靶點”網絡。

2.2.5 GO基因功能注釋和KEGG通路富集分析 采用DAVID數據庫進行關鍵靶點的基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，OmicShare tool對所得結果進行可視化分析。

3 結果

3.1 動物實驗

3.1.1 敦煌平胃丸對裸鼠移植瘤體積的影響 與對照組比較，順鉑組、敦煌平胃丸組裸鼠移植瘤體積均降低(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 敦煌平胃丸對裸鼠移植瘤體積的影響

3.1.2 敦煌平胃丸對裸鼠移植瘤病理形態學的影響 圖1顯示，對照組裸鼠瘤體細胞排列紊亂，異型性明顯，病理性核分裂象多見；順鉑組裸鼠腫瘤細胞排列疏松，異型性較對照組下降，細胞核固縮深染較多；敦煌平胃丸組裸鼠癌細胞排列疏松，異型性較對照組下降，部分細胞見核固縮及核碎裂，瘤體出現小部分壞死。

圖1 各組裸鼠移植瘤病理形態學(HE，×400)

3.1.3 敦煌平胃丸對裸鼠移植瘤凋亡率的影響 表2、圖2顯示，與對照組比較，順鉑組、平胃丸組裸鼠腫瘤細胞凋亡率均增加(P<0.01)。

表2 敦煌平胃丸對裸鼠移植瘤凋亡率的影響

3.2 網絡藥理學

3.2.1 敦煌平胃丸有效成分 采用TCMSP、TCMID數據庫得到全方成分548種，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為標準篩選得到成分133種，見表3，根據2020年版《中國藥典》可知，其中包括大黃質控成分大黃酸、有效成分蒽醌類等，苦參質控、有效成分槐果堿、槐胺堿、苦參堿、槐定堿等，附子質控、有效成分烏頭堿、次烏頭堿及多種二萜生物堿，干姜、藁本、當歸質控、有效成分揮發油，防風質控成分5-O-甲維阿斯米醇和有效成分色原酮類，人參質控成分人參皂苷，玄參質控成分哈巴俄苷等。可能受到現階段研究成果的限制，導致部分質控成分不符合ADME過程的關鍵參數OB、DL，如大黃素、大黃酚、桔梗皂苷D、6-姜辣素、升麻素苷、阿魏酸、哈巴苷，故未列在有效成分中。“藥物-成分”網絡見圖3。

表3 敦煌平胃丸有效成分

續表3

續表3

圖3 “藥物-有效成分”網絡圖

圖4 “成分靶點-疾病靶點”網絡圖

3.2.2 成分靶點-疾病靶點網絡 采用TCMSP、BATMAN-TCM、TCMID數據庫對“3.2.1”項下133種有效成分進行對應靶點的檢索，去重后得到成分靶點670個；采用HPO、OMIM、TTD、CNKI、萬方、NCBI數據庫，去重后得到疾病靶點720個，兩者共同靶點71個，“成分靶點-疾病靶點”網絡見圖4。

將2種靶點輸入String數據庫，交互置信區間>0.9，剔除與胃癌相關性不強的靶點，得到1 202個節點、10 315條邊的全靶點互作網絡，導入cytoscape軟件后，采用Network Analyzer(節點的度數>中位數、介數>0.02、緊密度>0.36)和Mcode插件分析網絡的拓撲性質，篩選得到網絡中心靶點18個，分別為TP53、Akt1、MAPK1、ESR1、EGFR、INS、STAT3、PIK3CA、GNB1、JUN、SRC、PRKACA、HSP90AA1、CDK1、ITGB1、RAC1、F2、PPP2R1A、CXCL8，見圖5。

圖5 靶點網絡拓撲分析所得中心靶點

采用cytoscape軟件中的的Mcode插件對全靶點網絡進行聚類，構建功能模塊，以K-Core≥2得到分子功能相近的聚類35個(表4)，獲得種子靶點(seed node)32個，分別為HTR1F、ADRBK1、FOXM1、Akt1、GABRG1、BCL3、HSD17B2、CHRNB3、CACNA1H、COL11A1、ADH1B、FPGS、TAZ、PRKAR1A、GPC5、SLC9A1、HSP90AA1、TUBB4A、FOXA1、SDHB、PDE10 A、CDA、CHEK2、LEPREL2、EPHA2、GLO1、SOAT2、NR2C2、CD55、RDH13、NPPC、NR1D1。將71個共同靶點與拓撲分析得到的中心靶點、功能模塊分析得到的種子靶點合并去重后，得到關鍵靶點111個，采用cytoscape軟件進行拓撲分析，得到PPI網絡圖(圖6)，圖中節點顏色越深代表節點的“degree”越高，節點越大代表“betweenness centrality”越高。

3.2.3 敦煌平胃丸與胃癌“藥物-成分-關鍵靶點”網絡分析 將“3.2.2”項下靶點分別輸入TCMSP、TCMID、Batman-TAM，檢索對應的成分，去掉未找到明確成分的靶點后得到關鍵靶點103個，找到其對應的關鍵有效成分84種及歸屬的單味藥，統計成分數量(表5)，將關鍵靶點、對應關鍵成分、成分歸屬導入cytoscape軟件，得到“藥物-成分-關鍵靶點”網絡圖(圖7)。由此可知，敦煌平胃丸對胃癌的治療作用是多靶點的，方中除土鱉蟲外篩選到多種關鍵成分干預多個核心靶點，包括大黃、附子、苦參、玄參、人參質量控制成分及大黃中蒽醌類、附子中三萜生物堿、干姜和藁本中揮發油、桔梗中黃酮、防風中色原酮等，可由1種或多種單藥提供，并且干預多個靶點，充分體現了中藥復方“多點顯效，協同增效”的特點。

表4 “成分靶點-疾病靶點”網絡的MCODE模塊化分析

圖6 重要靶點PPI網絡圖

3.2.4 KEGG通路富集分析 采用DAVID數據庫對上述103個關鍵靶點進行KEGG通路富集分析，發現有與癌癥、炎癥、免疫等密切相關的通路16 536條，以通路所含靶點數量進行排序，采用OmicShare tool對靶點數量前20的通路進行可視化分析，分別為癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的MicroRNAs、乙型肝炎、粘著斑通路、前列腺癌、膀胱癌、HIF-1信號通路、胰腺癌、HTLV-I感染、慢性粒細胞白血病、甲狀腺激素信號通路、FoxO信號通路、Ras信號通路、黑色素瘤、癌癥中的轉錄失調、病毒的致癌作用、癌癥的中心碳代謝、膠質瘤，見圖8。

表5 敦煌平胃丸防治胃癌關鍵靶點、可干預關鍵靶點的成分數量及其歸屬

圖8 KEGG通路富集分析圖

3.2.5 GO富集分析 采用Uniport數據庫和OmicShare tool，得到敦煌平胃丸治療胃癌關鍵靶點的GO富集，見圖9。生物過程(biological process，BP)涉及細胞增殖、發展過程、生物過程的正、負調節、信號傳導、多細胞組織過程、生物調控、運動、對刺激的反應、多生物過程、代謝過程、免疫系統過程、生物粘附、節律過程、生長、細胞成分組織或生物發生、生殖過程、繁殖、生物過程調控、定位、解毒、行為、細胞過程、氮素利用、色素沉著；分子功能(molecular function，MF)包含分子功能調節劑、催化活性、轉錄調節活性、抗氧化活性、分子傳感器活性、被劫持的分子功能、結合、轉運活性、翻譯調節器活動、結構分子活性；細胞成分(cellular component，CC)涉及細胞器部分、細胞器、膜封閉腔、含蛋白質復合物、細胞部分、細胞、突觸、細胞外區、膜、突觸部分、胞外區部分、細胞連接、其他有機體、其他有機體部分、超分子復合體、膜部件，可見敦煌平胃丸復方關鍵靶點通過多種生物過程發揮了復雜的分子功能，涉及多種細胞組分。

圖9 GO富集分析圖

4 討論

中醫講胃癌病機多為“凝痰聚瘀、胃失和降”。而敦煌平胃丸全方標本兼顧，可治脾胃陽虛脾不運化引起的寒熱錯雜、氣滯血瘀和升降失調，已用于治療胃癌癌前病變，具有較高的臨床價值。且本方來自敦煌遺書的殘卷，亦具有重要的史料價值[2]。本研究首先采用胃癌荷瘤裸鼠模型，證實敦煌平胃丸對胃癌移植瘤具有顯著的抑瘤作用。同時，實驗發現敦煌平胃丸組的裸鼠一般狀況較順鉑組良好，提示敦煌平胃丸在發揮抑瘤作用的同時對機體不良影響較小，值得進一步研究開發。但該復方抑制胃癌的物質基礎和作用機制尚不清楚。

網絡藥理學基于系統生物學的理論，從系統的角度和分子的水平上預測中藥化合物的靶向和藥理作用[3]，可從各層次水平研究藥物效果[4]。故本研究采用多個中醫藥生物信息研究的平臺互相補充，篩選敦煌平胃丸治療胃癌的關鍵靶點，并將關鍵靶點對應的活性成分及歸屬藥物進行分析。結果顯示，敦煌平胃丸復方含有可能對胃癌揮發治療作用的成分133種，本研究選擇作用靶點大于30的成分，分別是大黃中的大黃酸、蘆薈大黃素；附子中的惰堿、去氧穿心蓮內酯、次烏頭堿、去氧穿心蓮內酯；苦參中的去氧穿心蓮內酯、臭豆堿、槐胺、槐果堿、槲皮素、8-異戊烯基山柰酚、苦參素；防風中的漢黃芩素；苦參、桔梗中均含有的木犀草素；人參中的菊黃質、石竹胺；當歸中的豆甾醇。藥理研究顯示大黃酸能通過線粒體途徑誘導SGC-7901細胞凋亡，影響凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Bcl-xL、pro-caspase-3和炎癥相關蛋白TNF-α和白細胞介素6的水平變化[5]。蘆薈大黃素通過線粒體凋亡途徑和ROS依賴的方式提高AGS腫瘤細胞的細胞毒性[6]。槐果堿是不僅在G0/G1期引起胃癌細胞周期阻滯和細胞凋亡，而且對胃癌細胞PI3K/Akt信號通路有劑量依賴性抑制作用[7]。槲皮素為黃酮類化合物，通過誘導細胞凋亡、壞死、自噬、和抗螺桿菌活性，增強抗癌藥物療效[8]。臭豆堿通過線粒體介導的凋亡途徑對人宮頸癌細胞株有抑制增殖作用[9]。苦參素通過抑制NS5A阻斷PI3K-Akt-mTOR途徑保護腸道黏膜[10]。去氧穿心蓮內酯不僅具有抗炎的活性，亦可造成肝和膽管癌細胞G0/G1和G2/M期的細胞周期阻滯[11]。惰堿、次烏頭堿、脫氧烏頭堿等二萜生物堿對胃癌、肝癌、肺癌等腫瘤細胞的離子通道、物質轉運有影響[12]。漢黃芩素能通過VEGFR2酪氨酸磷酸化、STAT3信號通路、鈣網蛋白/膜聯蛋白A1暴露等影響腫瘤免疫[13]。木犀草素能與姜黃素協同抑制TNF-α引起的炎癥[14-15]，豆甾醇一方面通過線粒體介導的細胞凋亡抑制胃癌細胞增殖，另一方面還具有抑制腫瘤細胞遷移和誘導G2/M細胞周期阻滯作用[16]。在這些分子中槐胺、8-異戊烯基山柰酚、菊黃質、石竹胺在胃癌治療中的具體功能有待進一步研究。在對103個關鍵靶點進行分析時，本研究得到了對應有效成分大于等于10的關鍵靶點PTGS2、HSP90AA1、SCN5A、ADRB2、AR、PIM1、SLC6A4、TNF，其中PTGS2已是評估臨床I期胃癌患者生存率的生物標記物，參與多條癌癥相關的信號通路[17]，并可調節T細胞信號敏感性，改變癌癥免疫應答期間CD4+T細胞的行為[18]。HSP90AA1在介導NANOG-TCL1A軸和腫瘤細胞的多侵襲性之間起到關鍵作用[19]。ADRB2拮抗劑能顯著抑制胃癌的生長和轉移，并在癌癥進展和耐藥性中起重要作用[20-21]。癌基因PIM1能通過影響糖酵解關鍵基因MYC促進癌細胞增殖[22]。SLC6A4在胃黏膜DNA甲基化模式的改變可能與功能性消化不良的發生有關[23]。進一步對重要靶點進行KEGG通路和GO分析顯示，富集前20通路為在癌細胞的糖脂代謝、增殖、凋亡、分化、侵襲、轉移及微環境調節等多方面發揮作用的重要通路。

綜上所述，本研究通過胃癌移植瘤模型證實了敦煌平胃丸對胃癌有明顯的抑制效果，再通過網絡藥理學從胃癌發生發展涉及多靶點、多通路、多步驟的角度分析了敦煌平胃丸治療胃癌是“多點顯效，協同增效”的模式，最終得到有效化學成分與靶系統協同作用的“合”的網絡[4]，這為后續進行多種成分的配伍、優化配方提供了實驗和理論基礎。